Imaging time-lapse di cellule vive della predazione di Bdellovibrio bacteriovorus su E. coli
JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologia
0 visualizzazioni • 3:21 min • February 26th, 2026
Inizia con una piastra di Petri contenente una co-cultura di Bdellovibrio bacteriovorus, un batterio predatore, e E. coli, la sua preda, sotto un cuscinetto di agarosio.
Il tappeto dell'agarosio mantiene E. coli immobilizzata, mentre B. bacteriovorus rimane mobile e invade attivamente le cellule prede.
Il predatore esprime un marcatore citoplasmatico rosso e un tag fluorescente verde fuso a una sottounità della DNA polimerasi per la visualizzazione.
Fissa il piatto in un supporto e applica olio a immersione sulla base del piatto e sull'obiettivo del microscopio per una risoluzione ottimale.
Monta il supporto sul microscopio e configuralo per il rilevamento della fluorescenza a doppio canale.
Usa ottica a campo chiaro per localizzare il piano focale e selezionare più campi di imaging non sovrapposti.
Imposta i parametri di time-lapse per catturare sia immagini in campo chiaro che fluorescenti in modo sequenziale a intervalli definiti.
Questo metodo consente di osservare la predazione iniziando con l'attacco e l'invasione della preda, seguita dalla trasformazione delle cellule prede, la crescita filamentosa, la septazione, la formazione della progenie e la conclusione con la lisi delle cellule prede.
Per la microscopia a fiorescenza time-lapse della co-cultura, si posiziona la piastra in un supporto per piastre di Petri in modo che la piastra non si muova durante l'esperimento e si inserisce una goccia di olio a immersione sull'obiettivo del microscopio rovesciato e una goccia sul fondo della piastrella. Montare il supporto sul palco del microscopio all'interno della camera del microscopio rovesciato e nel software del microscopio impostare l'ingrandimento a 100X e la lente policroma a GFP e mCherry. Usando un oculare in Brightfield, localizza il piano focale e apri il pointlist manager.
Sposta il palco e usa il pulsante Punti per memorizzare le coordinate di almeno 10 posizioni di interesse. Sposta la valvola della telecamera dall'oculare al monitor. Imposta il piano focale e clicca sul pulsante Sostituisci Punto nel gestore della lista punti per calibrare ogni punto.
Apri il designer dell'esperimento e sblocca la scatola di impilamento malattie. Seleziona i canali fluorescenti appropriati e le impostazioni ottimali di illuminazione e imposta gli intervalli tra l'acquisizione dell'immagine e il tempo totale dell'esperimento. Abilita la manutenzione del focus per le posizioni scelte e seleziona la cartella dati in cui i file immagine devono essere salvati automaticamente.
Controlla tutte le impostazioni nel controllo software del microscopio e avvia l'esperimento time-lapse. Dopo la prima ora dell'esperimento, verifica che tutte le posizioni del palco siano ancora a fuoco. Quando l'esperimento time-lapse è terminato, rimuovere la piastra di Petri e scartare la piastra da 35 millimetri con un tampone di agarosio secondo i protocolli di biosicurezza appropriati.
Panoramica
In questo articolo viene descritto un metodo per osservare il comportamento predatorio di Bdellovibrio bacteriovorus su E. coli mediante microscopia a fluorescenza con acquisizione temporale. L'allestimento consente la visualizzazione delle diverse fasi della predazione, inclusi l'attacco, l'invasione e la lisi delle cellule preda.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Microbiologia
- Biologia cellulare
- Microscopia a fluorescenza
Sfondo
- Bdellovibrio bacteriovorus è un batterio predatore noto per la sua capacità di invadere e consumare altri batteri.
- E. coli funge da organismo modello preda in questo studio.
- La microscopia a fluorescenza in time-lapse è una tecnica potente per osservare processi biologici dinamici.
- L'uso di marcatori fluorescenti permette la visualizzazione di eventi cellulari specifici durante la predazione.
Scopo dello studio
- Osservare in tempo reale il processo di predazione di B. bacteriovorus su E. coli.
- Documentare le fasi della trasformazione e della lisi della cellula preda.
- Perfezionare le tecniche di microscopia per una migliore visualizzazione delle interazioni microbiche.
Metodi Utilizzati
- Co-coltura di B. bacteriovorus e E. coli in una piastra di Petri.
- Applicazione di olio di immersione per migliorare la risoluzione microscopica.
- Configurazione del microscopio per la rilevazione della fluorescenza a due canali.
- Acquisizione di immagini in time-lapse per catturare gli eventi sequenziali durante la predazione.
Risultati principali
- Visualizzazione riuscita del processo di predazione, dall'attacco alla lisi.
- Documentazione della trasformazione delle cellule di E. coli durante la predazione.
- Identificazione delle fasi chiave nel ciclo vitale di B. bacteriovorus.
- Messa a punto di un metodo affidabile per futuri studi sulla predazione microbica.
Conclusioni
- Lo studio fornisce informazioni sulle dinamiche della predazione batterica.
- La microscopia a fluorescenza con time-lapse è efficace per osservare le interazioni microbiche.
- I risultati contribuiscono alla comprensione delle relazioni predatore-preda negli ecosistemi microbici.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La visualizzazione in tempo reale della dinamica della predazione batterica supporta la riduzione dei rischi meccanicistici nella validazione di bersagli antimicrobici, consentendo l'osservazione diretta delle interazioni tra ospite e patogeno. Questo approccio fornisce dati quantitativi risolti nel tempo sulla lisi batterica e sul rilascio della progenie, fornendo indicazioni sulla affidabilità predittiva dei saggi di screening antimicrobico. Il metodo collega la biologia della scoperta e la microbiologia traslazionale stabilendo un sistema rilevante per la malattia per la valutazione di nuove strategie antibatteriche.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante la visualizzazione in tempo reale dell'invasione batterica e della replicazione intracellulare.
- Valore operativo: Supporta la validazione funzionale di bersagli attraverso l'osservazione diretta della trasformazione delle cellule preda e della cinetica della lisi.
- Valore predittivo: Facilita la riduzione del rischio meccanicistico dei candidati antimicrobici correlando interventi molecolari con gli esiti della predazione.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Prontezza del saggio: Genera letture quantitative standardizzate di fluorescenza per lo screening ad alto contenuto di composti antibatterici.
- Riproducibilità: La configurazione del bersaglio immobilizzato garantisce una selezione coerente del campo e il mantenimento della messa a fuoco durante esperimenti a intervalli di tempo.
- Scalabilità: Il gestore di punti multiposizione consente la raccolta parallela di dati da campi di imaging definiti per analisi comparative.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le Malattie: Stabilisce un modello controllato ospite-patogeno per studiare la dinamica della predazione microbica rilevante per i meccanismi di infezione.
- Continuità Translazionale: Collega osservazioni a livello di scoperta alla valutazione preclinica dell'efficacia antibatterica e dello sviluppo di resistenza.
- Decisioni Adeguate al Rischio: Fornisce endpoint visivi e quantitativi per decisioni di avanzamento o interruzione nello sviluppo precoce di antimicrobici.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nei flussi di lavoro di scoperta di agenti antimicrobici consentendo il monitoraggio in tempo reale della vitalità batterica e dei cambiamenti strutturali durante l'esposizione al composto, supportando l'identificazione e l'ottimizzazione dei composti promettenti.
- Biologia della scoperta: La visualizzazione diretta delle fasi della predazione supporta la verifica di ipotesi e la chiarificazione dei percorsi nelle interazioni ospite-microbo.
- Screening: Il rilevamento di fluorescenza a doppio canale consente il tracciamento simultaneo della localizzazione del predatore e della replicazione del DNA della preda per letture saggio multiplex.
- Analisi: L'acquisizione in time-lapse di attacco, invasione, crescita filamentosa, settazione e lisi permette un'analisi cinetica quantitativa degli effetti antibatterici.
- Ricerca traslazionale: L'osservazione in tempo reale della lisi delle cellule preda supporta l'allineamento dei biomarcatori con il meccanismo d'azione antimicrobico.
- Riutilizzo aziendale: Una configurazione standardizzata della microscopia e la calibrazione della pointlist consentono il riutilizzo su diversi modelli di predazione e screening di composti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica nell'azione antimicrobica fornendo una visualizzazione diretta della dinamica della predazione batterica.
- Valore operativo: La configurazione immobilizzata delle prede e il mantenimento del fuoco migliorano la riproducibilità e riducono la variabilità sperimentale.
- Valore strategico: Permette decisioni basate sui dati riguardo al proseguimento o meno di uno studio, collegando il trattamento con il composto all'inibizione o al potenziamento della predazione osservabili.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione dei candidati antimicrobici in base all'efficacia in tempo reale e ai profili di resistenza, corretta per il rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in microscopia a fluorescenza, acquisizione temporizzata di immagini e tecniche di co-coltura batterica.
- Richiede un microscopio invertito dotato di fluorescenza a doppio canale, compatibilità con olio di immersione e hardware per la stabilizzazione del piatto.
- Necessita della standardizzazione dello spessore del pad di agarosio e dei protocolli di immobilizzazione delle prede tra diversi utenti e laboratori.
- Le considerazioni per l'adattamento includono la compatibilità dei marcatori fluorescenti con diverse ceppi batterici e sistemi predatore-preda.
- I limiti pratici comprendono i rischi di fototossicità dovuti a un'illuminazione prolungata e la diffusione dell'agarosio che può compromettere l'immobilizzazione a lungo termine.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
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Ultimo aggiornamento: 22 agosto 2026