JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Microbiologia
0 visualizzazioni • 3:16 min. • March 31st, 2026
Inizia con un topo co-infettato da un batterio patogeno e un virus.
Il virus danneggia il rivestimento epiteliale delle vie respiratorie superiori del topo, facilitando la diffusione dei batteri dal nasofaringe ai polmoni.
Inserire i polmoni di topo raccolti in una tetola contenente soluzione salina tamponata con fosfato, o PBS.
Trita i polmoni in piccoli pezzi e mescola bene.
Trasferire metà del tessuto polmonare in un tubo contenente PBS.
Inserire una sonda omogeneizzatrice del tessuto sterilizzato all'interno del tubo contenente il tessuto polmonare.
Omogeneizzare il tessuto per liberare i batteri nel PBS.
Diluire l'omogeneato e implattare le diluizioni su una piastra d'agar ricca di nutrienti.
Incubare la piastra per permettere la formazione delle colonie batteriche.
Contare queste colonie per quantificare il carico batterico polmonare, che riflette il carico batterico nei polmoni.
Per la raccolta polmonare, usando forbici dissecanti, taglia i lati della gabbia toracica esposta e tira delicatamente le costole verso la testa del topo per esporre il cuore. Inserisci un ago calibro 25 attaccato a una siringa da 10 millilitri pre-piena di PBS nel ventricolo destro e inizia a perfusere lentamente. Cerca lo sbiancamento dei polmoni come indicatore di una perfusione di successo.
Sciacquica lentamente per evitare di rompere il tessuto polmonare. Solleva il cuore con la pinza e fai un taglio per separare polmoni e cuore. Una volta separati, raccogli tutti i lobi del polmone con una pinza e risciacquali in una ciotola con PBS sterile per rimuovere eventuali residui di sangue.
In una piastra di Petri, trita il polmone in piccoli pezzi e mescola bene. Rimuovere metà della miscela polmonare per determinare la CFU batterica o PFU virale e inserirla in un tubo da 15 millilitri a fondo rotondo pre-riempito con 0,5 millilitri di PBS per l'omogeneizzazione.
Per omogeneizzare il tessuto raccolto, pulisci la sonda omogeneizzatrice mettendola al 70% di etanolo e accendi l'omogeneizzatore al 60% di potenza per 30 secondi. Ripeti questo passaggio in acqua sterile per 10 secondi.
Omogeneizzare ogni tessuto per 1 minuto. Per l'enumerazione dei numeri batterici, diluizioni seriali delle placche sulle placche di agar nel sangue. Per calcolare la CFU totale, si usano 10 microlitri per placcare e annota il volume finale in millilitri per ogni campione. Incubare durante la notte a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica.