Name: Registrazioni postsinaptica a dendriti afferenti contattare cocleari cellule ciliate interne: Release multivescicolari monitoraggio a Synapse Ribbon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-10T16:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 45 s
Description: Scopri la tecnica di patch-clamp whole-cell per registrare l'attività postsinaptica alle sinapsi afferenti delle cellule ciliate interne nella coclea di ratto. Questo metodo elettrofisiologico permette di studiare la trasmissione sinaptica nell'udito.

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Questo lavoro è stato supportato da una ricerca sordità Research Foundation Grant a EY e dell&#39;NIDCD DC006476 di EG e dell&#39;NIDCD DC005211 al Centro per l&#39;udito e l&#39;equilibrio, Johns Hopkins University. Opere d&#39;arte d&#39;autore Tim Phelps, Johns Hopkins University. LG ha scritto il manoscritto iniziale; EY e LG girato la dissezione e la registrazione. Tutti gli autori hanno fornito dati esemplare e ha contribuito alla stesura del manoscritto.

<ol><li>Glowatzki, E., Fuchs, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmitter+release+at+the+hair+cell+ribbon+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Transmitter release at the hair cell ribbon synapse.</a> Nat Neurosci. 5 (2), 147-154 (2002).</li>
<li>Goutman, J. D., Glowatzki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+and+calcium+dependence+of+transmitter+release+at+a+single+ribbon+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Time course and calcium dependence of transmitter release at a single ribbon synapse.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (41), 16341-16346 (2007).</li>
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<li>Grant, L., Yi, E., Glowatzki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+modes+of+release+shape+the+postsynaptic+response+at+the+inner+hair+cell+ribbon+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Two modes of release shape the postsynaptic response at the inner hair cell ribbon synapse.</a> J Neurosci. 30 (12), 4210-4220 (2010).</li>
<li>LoGiudice, L., Matthews, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+ribbons+at+sensory+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">The role of ribbons at sensory synapses.</a> Neuroscientist. 15 (4), 380-391 (2009).</li>
<li>Singer, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+multivesicular+release+at+a+mammalian+ribbon+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Coordinated multivesicular release at a mammalian ribbon synapse.</a> Nat Neurosci. 7 (8), 826-833 (2004).</li>
<li>Keen, E. C., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+characteristics+of+the+hair+cell%27s+afferent+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transfer characteristics of the hair cell's afferent synapse.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (14), 5537-5542 (2006).</li>
<li>Li, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unitary+event+underlying+multiquantal+EPSCs+at+a+hair+cell%27s+ribbon+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The unitary event underlying multiquantal EPSCs at a hair cell's ribbon synapse.</a> J Neurosci. 29 (23), 7558-7568 (2009).</li>
<li>Singer, J. H., Diamond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+depletion+and+synaptic+depression+at+a+mammalian+ribbon+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Vesicle depletion and synaptic depression at a mammalian ribbon synapse.</a> J Neurophysiol. 95 (5), 3191-3198 (2006).</li>
<li>Suryanarayanan, A., Slaughter, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+transmission+mediated+by+internal+calcium+stores+in+rod+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic transmission mediated by internal calcium stores in rod photoreceptors.</a> J Neurosci. 26 (6), 1759-1766 (2006).</li>
<li>Neef, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+mechanism+of+exocytosis+at+the+hair+cell+ribbon+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Probing the mechanism of exocytosis at the hair cell ribbon synapse.</a> J Neurosci. 27 (47), 12933-12944 (2007).</li>
<li>Tritsch, N. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+spontaneous+activity+in+the+developing+auditory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The origin of spontaneous activity in the developing auditory system.</a> Nature. 450 (7166), 50-55 (2007).</li>
<li>Kros, C. J., Ruppersberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+potassium+current+in+inner+hair+cells+during+development+of+hearing+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Expression of a potassium current in inner hair cells during development of hearing in mice.</a> Nature. 394 (6690), 281-284 (1998).</li>
<li>Muller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+changes+of+frequency+representation+in+the+rat+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Developmental changes of frequency representation in the rat cochlea.</a> Hear Res. 56 (1-2), 1-7 (1991).</li>
<li>Seal, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensorineural+deafness+and+seizures+in+mice+lacking+vesicular+glutamate+transporter+3%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Sensorineural deafness and seizures in mice lacking vesicular glutamate transporter 3.</a> Neuron. 57 (2), 263-275 (2008).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il passo cruciale in questa procedura è la dissezione. Se il tessuto è allungato o danneggiati durante la dissezione, fibre afferenti non sopravviverà. Tessuti più giovani ratti è più elastica e perdonare. Troviamo che giorno dopo la nascita 10 a 11 sono più facili da analizzare e gli esperimenti hanno percentuali di successo superiori. Un significativo grado di maturazione cocleare si verifica dopo la nascita, con i ratti iniziano a sentire da circa 12 14 giorni dopo la nascita. Pertanto, l&#39;età in cui la dissezione è più facile, sinapsi potrebbero non essere completamente maturo 4. La dissezione qui descritto per i ratti è essenzialmente lo stesso per i topi, la differenza principale è la dimensione più piccola della coclea mouse. Questa tecnica permette di proprietà delle sinapsi nastro da esaminare in topi modificati transgenically 15. Ulteriori modifiche a questa tecnica sono: l&#39;aggiunta di un colorante fluorescente alla soluzione intracellulare alle fibre etichetta 3; registrazioni in coppia con la cellula presinaptica ciliate interne e post-sinaptici afferenti Bouton, che consente la funzione di trasferimento tra le cellule pre e post sinaptica da determinare 2 e loose- sigillo registrazioni extracellulari a boutons afferenti per evitare la perdita di integrità cellulare. La configurazione di registrazione extracellulare è più facile da raggiungere rispetto alla cellula intera configurazione e gli esperimenti sono in genere più durevole.

È al di sopra delle attrezzature messe a punto nel nostro elettrofisiologici utilizzato per la registrazione da terminali afferenti.

registrazioni postsinaptica a dendriti afferenti contattare cocleari cellule ciliate interne: release multivescicolari monitoraggio a synapse ribbon

Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse

Le sinapsi afferenti tra la cellula ciliate interne (IHC) e la fibra di nervo uditivo fornisce un sito accessibile elettrofisiologico per la registrazione l&#39;attività postsinaptica di un singolo nastro sinapsi 1-4. Sinapsi nastro di cellule sensoriali rilascio dei neurotrasmettitori in continuo, il cui tasso è modulata in risposta ai cambiamenti classificati in IHC potenziale di membrana 5. Sinapsi nastro hanno dimostrato di operare con un comunicato multivescicolari, dove vescicole multiple può essere rilasciato contemporaneamente per evocare le correnti post-sinaptiche eccitatorie (EPSCs) di varia ampiezza 1, 4, 6-11. Né il ruolo del nastro presinaptico, né il meccanismo sottostante rilascio multivescicolari è attualmente ben compreso. L&#39;IHC è innervato da fibre del nervo uditivo 10-20, e tutti i contatti in fibra di IHC con un singolo amieliniche fine di formare una singola sinapsi nastro. Le piccole dimensioni del iHCS afferenti boutons contatto (circa 1 micron di diametro) permette le registrazioni con eccezionale risoluzione temporale da fare. Inoltre, la tecnica può essere adattata a registrare da entrambe le cellule pre-e post-sinaptici contemporaneamente, consentendo la funzione di trasferimento alla sinapsi da studiare direttamente 2. Questo metodo fornisce quindi un mezzo attraverso il quale gli aspetti fondamentali della neurotrasmissione può essere studiata, dalla versione multivescicolari alla funzione elusiva del nastro in cellule sensoriali.

Whole-cell patch-clamp registrazioni da dendriti delle fibre nervose uditivo interno alla sinapsi nastro capelli cellule nella coclea di mammifero.

Registrazioni postsinaptica a dendriti afferenti contattare cocleari cellule ciliate interne: Release multivescicolari monitoraggio a Synapse Ribbon

La sinapsi afferente tra la cellula ciliate interna (IHC) e la fibra del nervo uditivo fornisce un sito elettrofisiologicamente accessibile per la registrazione del...

L'obiettivo generale di questa procedura è registrare l'attività postsinaptica a livello delle sinapsi afferenti delle cellule ciliate interne. Questo viene ottenuto esponendo innanzitutto l'epitelio sensoriale di una coclea recentemente rimossa da un ratto decapitato. Il secondo passaggio della procedura consiste nel posizionare l'apice escisso su un cover slip modificato e trasferirlo nella camera di registrazione.Il terzo passaggio della procedura consiste nel localizzare e accedere a un bastoncello afferente mediante un elettrodo di registrazione. L'ultimo passaggio della procedura consiste nel formare un sigillo stretto sulla membrana della fibra afferente e successivamente romperla, stabilendo la configurazione a intera cellula della tecnica del patch clamp. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano l'insorgenza o i potenziali post-sinaptici da una singola sinapsi a nastro mediante elettrofisiologia in configurazione a intera cellula con la tecnica del patch clamp.La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché la dissezione e la preparazione del tessuto cocleare sono difficili da apprendere e le piccole fibre afferenti sono difficili da riconoscere e raggiungere. Prima di iniziare la dissezione, preparare un'ansa modificata in vetro che manterrà la preparazione in posizione durante le registrazioni. Utilizzando un'ansa circolare in vetro di otto-dodici millimetri, applicare una goccia di Sylgard parzialmente polimerizzato verso il bordo dell'ansa.Posizionare l'estremità spessa di un ago sottile per insetti sul vetrino. Tenere saldamente l'ago contro il vetro. Con una pinzetta, riscaldare il bordo di tenuta contro una spirale riscaldata per fissarlo.Preparare da 10 a 20 microelettrodi come descritto nel testo allegato. Dopo la lucidatura a fiamma con un microforno, il microelettrodo dovrebbe avere un diametro esterno della punta di circa un micron. Lo spessore finale della parete della pipetta è pari a circa un terzo di micrometro dopo l'anestesia e la decapitazione di un ratto di tre settimane di età.Iniziare la dissezione rimuovendo la pelle sezionando la testa ed estraendo il cervello. Per esporre l'osso temporale, rimuovere entrambi gli ossi temporali. Posizionare ciascun osso temporale in una bacinella da dissezione pulita contenente soluzione extracellulare standard. Il passaggio successivo consiste nel rimuovere l'osso che racchiude l'osso temporale, al fine di esporre la coclea.Tenere saldamente l'osso temporale alla base con una pinzetta. Individuare la finestra rotonda, la finestra ovale e la coclea. Orientare la coclea in modo che la finestra ovale e il lato spirale della coclea siano rivolti verso l'alto.Rimuovere l'eccesso di osso intorno al coclea. Utilizzare una seconda coppia di pinzette fini per staccare l'osso direttamente dal coclea, iniziando dall'area più trasparente rispetto al resto dell'osso. In questa zona l'osso è più sottile e più facile da rimuovere.Continuare a rimuovere l'osso intorno alla spirale apicale. Utilizzare forbici da microdissezione per tagliare il modiolo al di sotto del giro apicale. Successivamente, staccare il giro apicale dai giri inferiori della coclea.Prestare attenzione a proteggere la spirale apicale. Non deve essere tirata né stirata. Infine, rimuovere il giro apicale dalla coclea senza strappare eccessivamente il tessuto.Utilizzare pinzette fini per rimuovere il resto dell'osso. Il passaggio successivo consiste nel rimuovere la STR degli oculi e la membrana tiale. Rimuovere con attenzione la STR degli oculi, la striscia lucida di tessuto situata all'esterno della regione delle cellule ciliate.Assicurarsi di evitare la rimozione delle cellule ciliate sensoriali, che possono facilmente staccarsi insieme alla STR di oculis. Successivamente, utilizzare pinzette fini per staccare la membrana tiale. La membrana lucente e semitrasparente che si trova sopra le cellule ciliate sensoriali; ora rimuovere i tessuti e l'osso in eccesso e appiattire il preparato con le pinzette.Questo è necessario affinché il tessuto possa essere posizionato uniformemente sotto un perno. La dissezione è ora terminata. Posizionare il preparato sotto il perno sul vetrino coprioggetto preparato, avendo cura di collocare il perno lontano dalle cellule ciliate una volta completata la dissezione.Utilizzare pinzette per trasferire il preparato nella camera di registrazione, mantenendo una goccia di liquido extracellulare sul vetrino che sostiene il tessuto cocleare, e iniziare immediatamente la perfusione con soluzione extracellulare. Per garantire una migliore sopravvivenza del preparato, utilizzare l'obiettivo da 10x o l'obiettivo DIC ad immersione in acqua da 40x del microscopio. Per individuare il preparato, orientarlo in modo che gli elettrodi di registrazione possano avvicinarsi alle cellule ciliate interne perpendicolarmente alle loro pareti laterali.Se la visibilità della regione basale delle cellule ciliate interne è limitata perché il preparato è arrotolato, utilizzare un elettrodo di registrazione per spingere il margine esterno del preparato contro il vetrino coprioggetto, avendo cura di non premere direttamente sulle cellule ciliate interne. In questo preparato, l'elettrodo superiore tiene premuto il margine esterno del preparato, mentre l'elettrodo inferiore indica la posizione dei bastoncelli afferenti.Per riferimento, la telecamera NC 70 Nuv Con visualizza sul monitor l'immagine ingrandita al Forex per valutare se il tessuto nella regione delle cellule ciliate interne è sano. Individuare i fasci cigliari come punto di riferimento e mettere a fuoco in profondità fino a trovare i nuclei. Proseguire ulteriormente verso la base delle cellule ciliate interne con le relative terminazioni afferenti, quindi risalire fino a raggiungere sul monitor il livello dei nuclei.Ora individuare i bastoncelli afferenti intorno alla base delle cellule ciliate interne. I bastoncelli sono sferici o ellissoidali, hanno un diametro di circa un micron ed hanno un colore chiaro con aspetto lucente. È possibile trovarli regolando il fuoco verso l'alto e verso il basso.Il passo successivo consiste nel liberare un percorso verso le fibre afferenti utilizzando un elettrodo di registrazione con una punta di un micron riempita con soluzione intracellulare. Applicare una pressione positiva e utilizzare il micromanipolatore per posizionare l'elettrodo sulla preparazione. Utilizzare questo elettrodo per effettuare un'incisione nella preparazione a livello della base delle cellule ciliate interne.Spingere l'elettrodo tra lo strato sottile di cellule di sostegno e le cellule ciliate interne utilizzando una pressione positiva per creare un percorso di accesso alla zona alla base delle cellule ciliate interne. Rimuovere con attenzione l'elettrodo e sostituirlo con un elettrodo nuovo dotato di una punta dal diametro di un micron riempita con soluzione intracellulare. Utilizzando la pressione positiva per mantenere pulita la punta dell'elettrodo, spostare l'elettrodo di registrazione attraverso il foro di accesso attorno alle cellule di sostegno adiacenti verso il bastoncello afferente.Assicurarsi che la punta dell'elettrodo sia direttamente di fronte al baton afferente; i baton offrono maggiore resistenza al movimento della pipetta rispetto alle cellule di sostegno e alla membrana della cellula ciliata interna. Questa differenza può essere percepita mentre si muove la pipetta; spostare la pipetta su e giù e spingere per verificare che il bhuton si muova. Ciò indica che la punta della pipetta e il bhuton si trovano nello stesso piano di fuoco, con l'elettrodo premuto contro il bhuton afferente. Rilasciare contemporaneamente la pressione positiva e applicare aspirazione per formare un sigillo gigaohm.Applicare delicati impulsi di aspirazione per rompere la membrana all'interno dell'elettrodo e ottenere una registrazione in modalità cella intera. Se la cellula sigillata è un bastoncino afferente, si osservano piccoli transitori capacitivi in modalità registrazione in cella intera. Questa figura mostra un transitorio tipico registrato da una fibra afferente.Iniziare la registrazione dell'attività sinaptica. Se la fibra afferente non mostra un'attività spontanea, depolarizzare la cellula ciliata applicando una soluzione extracellulare con una concentrazione più elevata di potassio. Questa figura mostra le relazioni tipiche tra corrente e tensione per le fibre AFF a sinistra e le cellule ciliate interne a destra.Le relazioni corrente-tensione sono state registrate a un potenziale di mantenimento di meno 84 millivolt con incrementi di tensione da meno 124 millivolt a più 36 millivolt in passi di 10 millivolt. Le tensioni sono mostrate a destra di alcuni tracciati, concentrati sulle relazioni corrente-tensione di una fibra afferente. Si noti che le correnti postsinaptiche eccitatorie, o EPC, sono presenti durante la maggior parte dei passi di tensione.Le EPC hanno invertito un potenziale positivo a circa +6 mV. Questa registrazione è stata effettuata in presenza di tetradotossina per bloccare le correnti sodiche attivate dal voltaggio; senza questo bloccante, sarebbero comparse ulteriori correnti sodiche inward ad attivazione rapida, identificando la registrazione come proveniente da una fibra afferente. Si noti la corrente inward ad attivazione lenta a potenziali iperpolarizzanti.Questa corrente non è presente nelle cellule ciliate interne né nelle cellule di sostegno e fornisce un buon indicatore del fatto che la registrazione proviene da una fibra afferente. Queste registrazioni mostrano le relazioni corrente-tensione per una cellula ciliata interna. La freccia indica le correnti di potassio uscenti ad attivazione rapida a potenziali positivi.Questi sono seguiti da correnti al potassio rettificatrici ritardate a causa di un diametro ridotto della pipetta e di un'elevata resistenza di accesso. Le correnti delle cellule ciliate interne mostrate qui sono più piccole del previsto per ottenere registrazioni accurate delle correnti delle cellule ciliate interne. Si dovrebbero utilizzare pipette con resistenze di accesso più basse.Tuttavia, le registrazioni presentate qui dimostrano che le relazioni corrente-tensione delle cellule ciliate interne e delle fibre afferenti possono essere chiaramente distinte. Questa figura mostra correnti sinaptiche registrate da una fibra afferente. Si noti la dimensione e la forma variabili degli EPC.Le registrazioni sono state effettuate a temperatura ambiente con la tetra toina applicata per bloccare le correnti sodio dipendenti dal voltaggio. Questa figura mostra registrazioni simultanee da una cellula ciliata interna e da un bastoncino afferente contiguo. Un gradino di voltaggio è stato utilizzato per depolarizzare la cellula ciliata interna e, in risposta, sono state registrate correnti calcio entranti dalla cellula ciliata interna; l'afflusso di calcio provoca il rilascio del neurotrasmettitore e l'attivazione di correnti postsinaptiche eccitatorie (EPC) nel bastoncino afferente.Si noti che la depressione sinaptica appare durante una depolarizzazione di 50 millisecondi della cellula ciliata interna mentre si esegue questa procedura. È importante ricordare di prestare attenzione durante la dissezione e la preparazione del tessuto cocleare e di mantenere pazienza e ottimismo quando si tenta di registrare dai terminali afferenti.

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