Registrazioni postsinaptica a dendriti afferenti contattare cocleari cellule ciliate interne: Release multivescicolari monitoraggio a Synapse Ribbon

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di registrare l'attività post-sinaptica nelle sinapsi afferenti delle cellule ciliate interne. Ciò si ottiene esponendo prima l'epitelio sensoriale di una coclea recentemente rimossa da un ratto decapitato. La seconda fase della procedura consiste nel posizionare l'apicale asportato, accendere un vetrino coprioggetto modificato e trasferirlo nella camera di registrazione.

Il terzo passo della procedura consiste nell'individuare e ottenere l'accesso a un bastone afferente con un elettrodo di registrazione. La fase finale della procedura consiste nel formare una tenuta ermetica e quindi rompere la membrana della fibra afferente stabilendo l'intera configurazione cellulare della tecnica del patch clamp. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano l'occorrenza o i potenziali post-sinaptici da una singola sinapsi a nastro attraverso l'elettrofisiologia del patch clamp dell'intera cellula.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto la dissezione e la preparazione del tessuto cocleare sono difficili da apprendere e le piccole fibre afferenti sono difficili da riconoscere e accedere. Prima di iniziare la dissezione, preparare un vetrino coprioggetto modificato che manterrà la preparazione in posizione durante le registrazioni. Utilizzando un vetrino circolare da otto a 12 millimetri, applicare una goccia di protezione in syl semipolimerizzato verso il bordo del vetrino.

Posiziona l'estremità spessa di una spilla per insetti sottile sul vetrino coprioggetto. Tenere saldamente il perno dell'insetto contro il vetro. Con una pinza, riscaldare la protezione del davanzale contro una bobina riscaldata per indurirla.

Preparare da 10 a 20 microelettrodi come descritto nel testo allegato. Dopo la lucidatura a fuoco con una micro forgia, il microelettrodo dovrebbe avere un diametro esterno della punta di circa un micron. Lo spessore finale della parete della pipetta è pari a circa un terzo di micrometro dopo l'anestesia e la decapitazione di un ratto di tre settimane.

Iniziare la dissezione rimuovendo la pelle bi sezionando la testa e rimuovendo il cervello Per esporre l'osso temporale, rimuovere entrambe le ossa temporali. Mettere ogni osso temporale in una capsula di dissezione pulita contenente una soluzione extracellulare standard. Il passo successivo consiste nel rimuovere l'osso, incapsulando l'osso temporale, in modo da esporre la coclea.

Tenere saldamente l'osso temporale alla base con un paio di pinze. Identifica la finestra rotonda e ovale e la coclea. Orientare la coclea in modo che la finestra ovale e il lato a spirale della coclea siano rivolti verso l'alto.

Rimuovere l'osso in eccesso intorno alla coclea. Usa un secondo paio di pinze sottili per scheggiare l'osso direttamente dalla coclea, iniziando dall'area che è più trasparente del resto dell'osso. Qui l'osso è più sottile e più facile da rimuovere.

Continua a rimuovere l'osso intorno alla bobina apicale. Usa le forbici da dissezione micro per tagliare il modis sotto la curva apicale. Quindi scollegare la spira apicale dalle spire inferiori della coclea.

Fare attenzione a proteggere la spirale apicale. Non deve essere tirato o allungato. Infine, rimuovere il giro apicale dalla coclea senza strappare troppo il tessuto.

Usa una pinza fine per rimuovere il resto dell'osso. Il passo successivo consiste nel rimuovere l'STR dell'oculis e della membrana tiale. Rimuovere con cura l'STR degli oculi, la striscia lucida di tessuto situata al di fuori della regione delle cellule ciliate.

Assicurati di evitare di rimuovere le cellule ciliate sensoriali, che possono facilmente staccarsi insieme alla STR degli oculi. Quindi, usa una pinza fine per staccare la membrana tiale. La membrana lucida e semitrasparente che si trova sopra le cellule ciliate sensoriali ora taglia il tessuto e l'osso in eccesso e appiattisce la preparazione con la pinza.

Ciò è necessario affinché il tessuto possa essere posizionato uniformemente sotto uno spillo. La dissezione è ora terminata. Posizionare il preparato sotto il perno sul vetrino coprioggetti preparato, avendo cura di posizionare il perno lontano dalle cellule ciliate una volta completata la dissezione.

Utilizzare una pinza per trasferire il preparato nella camera di registrazione mantenendo una goccia di liquido extracellulare sul vetrino coprioggetti che trattiene il tessuto cocleare e iniziare immediatamente la profusione con la soluzione extracellulare. Per garantire una migliore sopravvivenza della preparazione, utilizzare l'obiettivo 10 x del microscopio o l'obiettivo DIC a immersione in acqua 40 x. Per localizzare la preparazione, orientare la preparazione in modo che gli elettrodi di registrazione possano avvicinarsi alle cellule ciliate interne ad angolo retto rispetto alle loro pareti laterali.

Se la visibilità della regione basale delle cellule ciliate interne è limitata perché il preparato è arricciato, utilizzare un elettrodo di registrazione per spingere il bordo esterno del preparato verso il basso contro il vetrino coprioggetti. Facendo attenzione a evitare di premere le cellule ciliate interne stesse. In questa preparazione, l'elettrodo superiore tiene il bordo esterno della preparazione verso il basso rispetto ai segni dell'elettrodo inferiore dove si trovano i manganelli afferenti.

Come riferimento, la telecamera NC 70 Nuv Con visualizza l'immagine ingrandita Forex sul monitor per valutare se il tessuto nella regione interna delle cellule ciliate è sano. Trova i fasci di capelli come punto di riferimento e concentrati verso il basso per trovare i nuclei. Concentrati più in basso verso la base delle cellule ciliate interne con le sue terminazioni afferenti e torna indietro fino a raggiungere il livello dei nuclei sul monitor.

Ora individua i bastoni afferenti attorno alla base delle cellule ciliate interne. I bastoni sono sferici o ellissoidali, hanno un diametro di circa un micron e sono di colore chiaro con un aspetto lucido. Li troverai concentrandoti su e giù.

Il passo successivo consiste nell'aprire un percorso verso le fibre afferenti utilizzando un elettrodo di registrazione con una punta da un micron riempita con soluzione intracellulare. Applicare una pressione positiva e utilizzare il micromanipolatore per manovrare l'elettrodo verso la preparazione. Utilizzare questo elettrodo per praticare un'incisione nella preparazione a livello della base interna delle cellule ciliate.

Spingere l'elettrodo tra il sottile strato di cellule di supporto e le cellule ciliate interne usando una pressione positiva per creare una via di accesso all'area alla base delle cellule ciliate interne. Rimuovere con cautela l'elettrodo e sostituirlo con un elettrodo nuovo con una punta di un micron di diametro riempita con soluzione intracellulare. Utilizzando una pressione positiva per mantenere pulita la punta dell'elettrodo, spostare l'elettrodo di registrazione attraverso il foro di accesso attorno alle celle di supporto adiacenti verso il bastone afferente.

Assicurarsi che la punta dell'elettrodo si trovi direttamente davanti ai manganelli afferenti per offrire una maggiore resistenza al movimento della pipetta rispetto alle cellule di supporto e alla membrana interna delle cellule ciliate. Questa differenza può essere avvertita quando la pipetta viene spostata, si muove la pipetta su e giù e si spinge per assicurarsi che il bhuton si muova. Ciò indica che la punta della pipetta e il bhuton si trovano sullo stesso piano di messa a fuoco con l'elettrodo premuto contro il bhuton afferente Rilasciare contemporaneamente la pressione positiva e applicare l'aspirazione per formare una tenuta giga ohm.

Applicare delicate raffiche di aspirazione per rompere la membrana all'interno dell'elettrodo per ottenere una registrazione dell'intera cellula. Se la cellula patchata è un bastone afferente, si osservano piccoli transienti capacitivi nella modalità di registrazione dell'intera cellula. Questa figura mostra il tipico transitorio registrato da una fibra afferente.

Inizia a registrare l'attività sinaptica. Se la fibra afferente non mostra attività spontanea, depolarizzare la cellula ciliata applicando una soluzione extracellulare con una concentrazione di potassio più elevata. Questa figura mostra le tipiche relazioni di tensione di corrente per le fibre AFF a sinistra e le cellule ciliate interne a destra.

Le relazioni di tensione di corrente sono state registrate con un potenziale di tenuta di meno 84 millivolt con incrementi di tensione da meno 124 millivolt a 36 millivolt positivi con incrementi di 10 millivolt. Le tensioni sono mostrate a destra di alcune tracce concentrandosi sulle relazioni di tensione di corrente da una fibra afferente. Si noti che l'evento post-sinaptico eccitatorio o EPC sono presenti durante la maggior parte dei passaggi di tensione.

Gli EPC hanno invertito un positivo a circa sei millivolt positivi. Questa registrazione è stata effettuata in presenza di tetra tossina per bloccare le correnti di sodio voltaggio-dipendenti senza il blocco Le correnti di sodio ad attivazione rapida verso l'interno sarebbero apparse anche nella registrazione e avrebbero identificato la registrazione come una registrazione in fibra afferente. Si noti che la corrente verso l'interno che si attiva lentamente a tensioni iperpolarizzanti.

Questa corrente non è presente nelle cellule ciliate interne o nelle cellule di supporto e fornisce una buona indicazione che la registrazione proviene da una fibra afferente. Queste registrazioni mostrano le relazioni di tensione corrente per una cellula ciliata interna. La freccia indica le correnti di potassio verso l'esterno che si attivano rapidamente a potenziali positivi.

A queste seguono correnti di potassio raddrizzatori ritardate a causa del diametro stretto della pipetta e dell'elevata resistenza all'accesso. Le correnti delle cellule ciliate interne mostrate qui sono più piccole del previsto per ottenere registrazioni accurate delle correnti delle cellule ciliate interne. Devono essere utilizzate pipette con resistenze di accesso inferiori.

Tuttavia, le registrazioni qui presentate dimostrano che le relazioni di tensione di corrente delle cellule ciliate interne e delle fibre afferenti possono essere chiaramente distinte. Questa figura mostra le correnti sinaptiche registrate da una fibra afferente. Si noti la dimensione e la forma variabili degli EPC.

Le registrazioni sono state effettuate a temperatura ambiente con tetra toin applicato per bloccare le correnti di sodio voltaggio-dipendenti. Questa figura mostra le registrazioni simultanee da una cellula ciliata interna e da un bastone afferente a contatto. È stato utilizzato un gradino di tensione per depolarizzare la cellula ciliata interna e, in risposta, sono state registrate correnti di calcio verso l'interno dalla cellula ciliata interna, l'afflusso di calcio provoca il rilascio di neurotrasmettitori e l'attivazione di EPC nel bastone afferente.

Si noti che la depressione sinaptica appare durante una depolarizzazione delle cellule ciliate interne di 50 millisecondi durante il tentativo di questa procedura. È importante ricordare di prestare attenzione alla dissezione e alla preparazione del tessuto cocleare e di rimanere pazienti e ottimisti quando si tenta di registrare da terminali afferenti.