Generazione di sferoplasti da batteri gram-negativi
JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologia
0 visualizzazioni • 4:02 min • February 26th, 2026
Prendiamo un substrato contenente un antibiotico bloccante la divisione cellulare.
Inoculalo con batteri Gram-negativi a forma di bastoncello.
Incuba con lo scuotito.
In presenza dell'antibiotico, i batteri continuano a crescere senza dividersi e formano lunghi filamenti.
Raccogli la coltura e centrifugala a bassa temperatura. Scartare il soprantantante e lavare i filamenti con una soluzione di saccarosio per prevenire la lisi.
Scartate la soluzione di saccarosio.
Aggiungi un tampone seguito da enzimi ed EDTA. L'EDTA indebolisce la membrana esterna, permettendo al lisozima di entrare e degradare lo strato di peptidoglicano.
Questo rimuove la parete cellulare, permettendo alla cellula batterica di restringersi. La DNasi I rompe il DNA cromosomico rilasciato dalle cellule e previene l'aggregazione cellulare.
Aggiungi una soluzione ipotonica con un leggero vortico, permettendo alla cellula di assorbire acqua.
Le membrane flessibili permettono alla cellula di assumere una forma sferica chiamata sferoplasto.
Trasferire un'aliquota contenente gli sferoplasti in due tubi con una soluzione isotonica raffreddata per stabilizzare gli sferoplasti.
Per preparare gli sferoplasti Gram-negativi di E. coli, diluire la coltura notturna in un rapporto 1 a 100 in 25 millilitri di TSB in una fiaschetta da 250 millilitri e riportare i batteri nell'incubatrice di scuotimento per altre 2,5 ore. Quando la soluzione raggiunge una densità ottica da 0,5 a 0,8 a 600 nanometri, si diluisce la coltura con un rapporto uno a dieci in TSB fresco in una nuova fiaschetta da 250 millilitri per una seconda incubazione di 2,5 ore con una concentrazione efficace finale di 60 microgrammi per millilitro di cefalessina.
Produrre filamenti a singola cellula di circa 50-150 micrometri di lunghezza, come visualizzati al microscopio lucico con un ingrandimento di 1000x. Centrifuga la soluzione batterica per raccogliere i filamenti e decantare il surnadante. Lava i filamenti con l'aggiunta delicata di un millilitro di saccarosio a 0,8 molari, facendo attenzione a non disturbare il pellet.
Dopo un minuto, elimina il surnatante senza disturbare il pellet e aggiungi i reagenti indicati nel rispettivo ordine ai filamenti. Dopo dieci minuti a temperatura ambiente, aggiungi gradualmente un millilitro di soluzione A per un periodo di un minuto, mentre si fa ruotare delicatamente la soluzione a mano. Incubare la soluzione per quattro minuti a temperatura ambiente, poi dividere la sospensione filamentosa in due aliquote uguali tra due tubi conici da 15 millilitri contenenti sette millilitri di soluzione B a quattro gradi Celsius. Successivamente, si bloccano i filamenti tramite centrifugazione e si utilizza una pipetta sierologica per rimuovere con cura tutto tranne uno o due millilitri del surnatante senza disturbare i pellet.
Usa una micropipetta p1000 per sospendere delicatamente i pellet. Controlla una piccola aliquota del campione per la formazione di sferoplasti tramite microscopia chimica. Lo sferoplasto può quindi essere conservato a meno 20 gradi Celsius per un massimo di una settimana o fino a quando non hanno attraversato tre cicli di congelamento e discongelamento.
Panoramica
In questo articolo viene descritto un metodo per la preparazione di sferoplasti da batteri Gram-negativi, in particolare da E. coli, mediante l'uso di un antibiotico inibitore della divisione cellulare. Il processo comprende diversi passaggi, tra cui incubazione, centrifugazione e l'impiego di reagenti specifici per indebolire la parete cellulare batterica.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Microbiologia
- Biologia cellulare
- Biotecnologia
Sfondo
- Le sferoplaste sono cellule con una parete cellulare parzialmente rimossa.
- Sono utili per lo studio dei processi cellulari e per applicazioni biotecnologiche.
- I batteri Gram-negativi possiedono pareti cellulari complesse che richiedono metodi specifici per la preparazione delle sferoplaste.
- L'uso di antibiotici può favorire la formazione di batteri allungati, più facili da manipolare.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo affidabile per produrre sferoplasti da E. coli.
- Facilitare lo studio dei processi cellulari batterici senza l'interferenza della parete cellulare.
- Ottimizzare le condizioni per la stabilità e la vitalità degli sferoplasti.
Metodi Utilizzati
- Innoculazione del terreno con batteri Gram-negativi a forma di bastoncello.
- Incubazione con un antibiotico inibitore della divisione cellulare per favorire la formazione di filamenti.
- Centrifugazione e lavaggio con saccarosio per prevenire la lisi.
- Utilizzo di EDTA e lisozima per indebolire e degradare la parete cellulare.
Risultati principali
- È stata ottenuta una formazione riuscita di sferoplasti da E. coli.
- I filamenti batterici sono stati visualizzati al microscopio.
- Sono state stabilite le condizioni per la stabilità degli sferoplasti.
- Gli sferoplasti possono essere conservati per un uso successivo senza una perdita significativa di vitalità.
Conclusioni
- Il metodo fornisce un approccio praticabile per lo studio dei batteri Gram-negativi.
- La comprensione della formazione dei sferoplasti può essere utile in varie applicazioni microbiologiche.
- Studi futuri possono basarsi su questo metodo per esplorare altre specie batteriche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La generazione di sferoplasti da batteri Gram-negativi consente un'analisi precisa dei processi associati alla membrana e della localizzazione di composti, fondamentale per la scoperta precoce di antimicrobici. Questa capacità supporta la riduzione del rischio meccanicistico e la validazione del bersaglio fornendo un sistema controllato per valutare le interazioni dei composti, eliminando l'influenza disturbante della parete cellulare batterica. Il metodo aumenta la fiducia predittiva nei flussi di lavoro di screening e di traduzione per i portafogli di ricerca e sviluppo di agenti anti-infettivi.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Consente la valutazione diretta della localizzazione dei peptidi antimicrobici e delle interazioni con la membrana.
- Facilita la validazione funzionale dei bersagli dell'involucro batterico rimuovendo la barriera della parete cellulare.
- Permette una riduzione del rischio meccanicistica isolando gli effetti della membrana dai contributi della parete cellulare.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce un sistema standardizzato per valutare la permeabilità e l'attività dei composti a livello della membrana.
- Migliora la riproducibilità e la valutazione quantitativa degli effetti dei composti sui sferoplasti.
- Prepara substrati biologici validati per analisi successive ad alto contenuto informativo o di tipo meccanicistico.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea con le strategie traslazionali dei biomarcatori consentendo la visualizzazione diretta della localizzazione del composto.
- Permette una continuità dalla fase di scoperta alla validazione preclinica per agenti che bersagliano le membrane.
- Riduce l'ambiguità biologica nella selezione dei modelli preclinici per programmi anti-infettivi.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo di generazione di sferoplasti si inserisce nel continuum della scoperta iniziale fino all'identificazione del composto capostipite, fornendo un ponte tra la validazione del bersaglio e lo screening di composti attivi sulle membrane.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sui meccanismi mirati alla membrana isolando la membrana interna.
- Screening: Fornisce sistemi riproducibili, privi di parete cellulare, per la valutazione quantitativa di composti.
- Analisi: Permette la misurazione diretta della localizzazione del composto e del danneggiamento della membrana mediante microscopia e saggi quantitativi.
- Ricerca traslazionale: Facilita l'allineamento dei risultati ottenuti in vitro con strategie in vivo mirate alla membrana.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per svariate iniziative di ricerca su agenti anti-infettivi e sulla biologia delle membrane.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella valutazione dei composti mirati alle membrane e nella validazione degli obiettivi.
- Valore operativo: Standardizza la preparazione degli sferoplasti per flussi di lavoro riproducibili e scalabili.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione del progetto chiarificando il meccanismo d'azione del composto a livello della membrana.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione adeguata al rischio dei composti attivi sulle membrane e riduce l'incertezza biologica nelle fasi avanzate.
Considerazioni relative all'implementazione
- Richiede competenze in biologia cellulare batterica e tecnica asettica.
- Necessita dell'accesso a infrastrutture per centrifugazione, microscopia e conservazione in freddo.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per le procedure di preparazione e manipolazione dei sferoplasti.
- Potrebbe essere necessaria un'adattamento per diverse specie Gram-negative o classi di composti.
- La stabilità e la vitalità dei sferoplasti sono limitate dai cicli di congelamento-scongelamento e dalla durata della conservazione.
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Ultimo aggiornamento: 22 agosto 2026