JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Microbiologia
0 visualizzazioni • 3:42 min. • February 26th, 2026
Consideriamo una coltura di Streptococcus del Gruppo B, o GBS, un patogeno batterico opportunista.
Diluire la coltura in substrati freschi e incubare per ottenere batteri attivamente in divisione.
Trasferisci la coltura in un tubo conico.
Centrifuga per pelletare i batteri, poi elimina il soprantantante.
Lava i batteri con il tampone.
Centrifuga di nuovo, rimuovi il surnatant e risospedi i batteri nel tampon.
Successivamente, utilizza una topo femmina trattata con ormoni e epitelio vaginale preparato, più suscettibile all'infezione.
Trattieni il topo. Utilizzando una punta fine a pipetta, eroga la sospensione GBS nel lumen vaginale.
Lascia andare il topo, sollevare la coda e lasciare che le zampe anteriori camminino su una superficie rigida.
Questo favorisce la ritenzione dell'inoculo nel lumen vaginale, favorendo l'aderenza al GBS.
Ispeziona l'apertura vaginale per il reflusso dell'inoculo.
I batteri aderiti colonizzano la superficie epiteliale vaginale e stabiliscono un'infezione.
Il modello murino con infezione vaginale è pronto per ulteriori studi.
Lo stesso giorno dell'iniezione, coltivare una coltura liquida notturna da cinque millilitri del ceppo GBS di interesse nel brodo Todd Hewitt, o THB, a 37 gradi Celsius.
La mattina seguente, subcoltura il GBS a un volume da 1 a 10 in THB fresco per un'incubazione di due o tre ore a 37 gradi Celsius, fino a raggiungere la fase centrale logaritmia. Successivamente, trasferire la sottocultura in un tubo conico sterile da 15 millilitri e centrifugare le cellule batteriche. Risospendere il pellet in 200 microlitri di PBS sterile.
Poi, si porta il volume totale della sospensione a 1 millilitro di PBS ogni 10 topi, per raggiungere un OD600 di 0,4 in un nuovo tubo da 5 millilitri da coltura. Trasferire la coltura in un nuovo tubo da 15 millilitri e rimettere i batteri in pellet. Poi, risospezione delle celle in PBS a un decimo del volume originale.
Riservare 50 microlitri del batterio per diluizione seriale e impiccatura su THB agar, per determinare l'esatta CFU dell'inoculo. Poi, prelevare 10 microlitri di GBS in una punta di pipetta a caricamento gel da 200 microlitri e fissare manualmente la pelle flaccida sulla coletta del collo del primo animale tra pollice e indice, seguita dall'immobilizzazione della coda. Inserire la punta della pipetta da 5 a 10 millimetri nel lumen vaginale e dispensare l'intero volume dell'inoculo.
Poi, lascia immediatamente la pelle e solleva la coda per sollevare la parte posteriore dell'animale, mentre cammina con le zampe anteriori su una superficie dura. Dopo un minuto, ispeziona visivamente l'apertura vaginale per eventuali riflussi di inoculo.