JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Microbiologia
0 visualizzazioni • 3:47 min. • February 26th, 2026
Inizia con due micropiatti a fondo di vetro contenenti sospensioni di un batterio che forma biofilm.
La piastra di trattamento contiene un enzima attivo che disturba la segnalazione, mentre il controllo include l'enzima inattivato.
Copri i piatti e incuba per permettere l'adesione batterica alla superficie del micropiatto.
Lavare per rimuovere le cellule non aderenti, poi introdurre un nuovo substrato contenente enzimi e incubare.
Nel piatto di controllo, i batteri comunicano tramite molecole di segnalazione e producono sostanze polimeriche extracellulari (EPS), formando un biofilm.
L'enzima attivo degrada le molecole di segnalazione, compromettendone la funzione e riducendo la formazione di biofilm.
Rifornire con un mezzo fresco e incubare ulteriormente per rafforzare gli effetti di biofilm dell'enzima.
Rimuovere il mezzo, aggiungere lectine etichettate con fluorescenze e incubare per permettere il legame delle lectine all'EPS.
Lava per rimuovere eventuali lectine non legate.
Incubare con un fissativo per preservare l'architettura del biofilm, poi sciacquare il piatto.
Acquisire immagini di microscopia confocale per valutare la soppressione mediata dagli enzimi della formazione di biofilm.
Per eseguire una microscopia a scansione laser confocale, o CLSM, dei biofilm S1 di A. baumannii , si coltiva una coltura da 5 millilitri di A. baumannii S1 in LB a 30 gradi Celsius in un incubatore a tremore per 16 ore. Regolare la coltura di A. baumannii S1 a un OD600 di 0,8.
Poi usa LB fresco contenente 1,2 milligrammi per millilitro di enzima GKL purificato per diluire la coltura, da 1 a 100, e aggiungi 1 millilitro a un microdish da 35 millilitri con fondo di vetro. Copri il micropiatto con un coperchio e mettilo in un contenitore di plastica da 10 litri e sigillalo prima di incubare il piatto a 30 gradi Celsius per tre ore. Dopo aver rimosso delicatamente il mezzo, aggiungi 1 millilitro di mezzo fresco contenente 30 microlitri di enzima GKL purificato, poi incuba a 30 gradi Celsius per altre 21 ore.
Rimuovi delicatamente il substrato una seconda volta e sostituisci con un altro 1 millilitro di enzima GKL in mezzo fresco. Incubare a 30 gradi Celsius per 24 ore. Dopo l'incubazione, rimuovere delicatamente il mezzo e aggiungere 500 microlitri di 5 microgrammi per millilitro di agglutinina coniugata di germe di grano Alexa Fluor 488 disciolta in HBSS.
Incubare il micropiatto a 37 gradi Celsius per 30 minuti per colorare i biofilm. Per fissare i biofilm, aggiungere 500 microlitri di formaldeide al 3,7% disciolto in HBSS e incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Usa 2 millilitri di HBSS per lavare il micropiatto una volta, poi rimuovi completamente la soluzione.
Conserva il piatto al buio a 4 gradi Celsius prima dell'imaging CLSM. Per l'imaging e l'analisi CLSM, si utilizza un obiettivo 63 X per generare 97 stack per immagine con un intervallo di 0,21 micron per stack.