Isolamento di batteri patogeni intracellulari da cellule ospiti infette

Prendi una sospensione di batteri patogeni.

Aggiungere la sospensione a una coltura aderente di macrofagi derivati dal midollo osseo o cellule BMDM e incubare.

I batteri utilizzano le proteine di superficie per legarsi ai recettori delle cellule ospiti, facilitando l'aderenza.

Risciacqua con un tampone per rimuovere i batteri non aderenti.

Aggiungi nuovi materiali e incuba.

I batteri aderiti vengono quindi interiorizzati dalla cellula ospite.

Aggiungi un antibiotico per eliminare i batteri non interiorizzati.

Scarta il supporto e lava con il tampone.

Aggiungi acqua fredda per lisare la cellula ospite, liberando contenuti cellulari, nucleo e batteri interiorizzati.

Raccogli il lisato cellulare e centrifuga per precipitare i detriti cellulari.

Raccogli il soprantantante contenente i batteri. Passala attraverso un dispositivo di filtrazione per catturare i batteri intatti.

Piega la carta filtro e mettila in un tubo.

Congelare rapidamente in azoto liquido per preservare l'integrità cellulare.

Conserva in condizioni di freddo per un uso successivo.

Utilizzando 0,5 millilitri della sospensione batterica lavata, infettare ogni piastra macrofagoica. Se si utilizzano più piatti, distanzia le infezioni di 15 minuti per permettere il prelievo di ciascun piatto individualmente alla fine dell'infezione. Dopo un'incubazione di 30 minuti a 37 gradi Celsius, si utilizza PBS per lavare due volte le cellule infette per rimuovere i batteri non attaccati, e poi aggiungi 30 millilitri di mezzo BMDM preriscaldato.

Incuba per 30 minuti per permettere ai batteri di interiorizzare. Un'ora dopo l'infezione, si aggiunge gentamicina a una concentrazione finale di 50 microgrammi per millilitro per eliminare eventuali batteri extracellulari rimasti. Assemblare l'apparato filtrante posizionando una testa filtrante su una fiaschetta di liquido raccoglitrice con una porta di uscita a vuoto.

Poi posiziona un filtro da 0,45 micron sulla testa del filtro, seguito da un imbuto a cilindro, e usa una fascetta metallica per fissare le diverse parti. Sei ore dopo l'infezione, esaminare il monostrato cellulare al microscopio prima del prelievo. Lavorando con una piastra alla volta per raccogliere i batteri, usa PBS per lavare le cellule infette.

Poi, per lisare le cellule macrofago, aggiungi 20 millilitri di acqua fredda e priva di RNAsi e usa rapidamente ma con attenzione un raschiatore per cellulari per raschiare via le cellule dalla placca. Dopo aver raccolto le cellule in un tubo conico da 50 millilitri, si fa vortice per 30 secondi, poi centrifuga a 800 volte g e 4 gradi Celsius per 3 minuti per rimuovere i nuclei cellulari dei macrofagi. Per raccogliere batteri, si fa passare il sovrantagente attraverso il filtro utilizzando il sistema a vuoto.

Poi, con una pinzetta, rotoli il filtro e trasferiscilo rapidamente in un tubo conico da 15 millilitri. Usa subito azoto liquido per congelare bruscamente il tubo.