Estrazione di RNA da Listeria monocytogenes raccolta da macrofagi murini infetti

Prendi un tubo con carta filtro contenente Listeria monocytogenes. Questi batteri vengono prelevati da macrofagi murini infetti.

Aggiungi un tampone contenente inibitori della RNasi per prevenire la degradazione dell'RNA, poi fai un vortice sul tubo in più angolazioni per spostare i batteri.

Centrifugare e trasferire la sospensione in un tubo contenente una miscela di fenolo–cloroformio–detersivo.

Vortice e incubano a temperatura elevata per disturbare le membrane batteriche, inattivare proteine e lisare i batteri, rilasciando componenti intracellulari.

Centrifuga per separare la fase acquosa ricca di RNA dagli altri componenti.

Raccogli l'RNA e trasferiscilo in un tubo contenente acetato di sodio ed etanolo.

Vortice, poi incubare a bassa temperatura.

L'acetato di sodio neutralizza la carica negativa dell'RNA, mentre etanolo e condizioni fredde favoriscono la precipitazione dell'RNA.

Centrifuga per pelletare l'RNA.

Rimuovi il sovrantantante e lava il pellet con etanolo freddo.

Centrifuga di nuovo, rimuovi il sovrantante, asciuga all'aria e aggiungi acqua senza RNasi.

Conserva l'RNA per ulteriori analisi.

Scongela i tubi contenenti i filtri su ghiaccio per mantenerli freddi. Poi a ogni provetta