Visualizzazione delle comunità batteriche intracellulari in una vescica di topo infetta

Inizia con una vescica di topo immobilizzata e dissezionata, pre-infettata da E. coli uropatogeno che esprime β-galactosidasi, inserita in una piastra multi-pozzetto rivestita di silicone.

Il lumen della vescica è rivolto verso l'alto, esponendo le cellule epiteliali che contengono comunità batteriche intracellulari, o IBC.

Lava la vescica con un tampone per rimuovere detriti e batteri non attaccati.

Successivamente, aggiungi un fissativo e incuba per preservare le strutture cellulari e batteriche.

Rimuovi il fissatore e lava con un buffer.

Poi, lava con un tampone contenente detersivo per permeabilizzare membrane cellulari e batteriche.

Rimuovere il tampon, poi aggiungere una soluzione di X-gal, un substrato di β-galactosidasi, integrata con reagenti redox, e incubare.

I reagenti X-gal e redox entrano nei batteri. β-galactosidasi taglia X-gal, producendo un intermedio incolore che viene ossidato da reagenti redox per formare un precipitato blu.

Sotto un microscopio dissezionale, i puntini blu nella vescica confermano gli IBC, indicando un'infezione delle vie urinarie.

Per l'enumerazione IBC, dopo aver prelevato la vescica, si mette in un pozzo rivestito di silicone di una piastra a 6 pozzi con PBS e si usa forbici per tagliarla a metà.

Utilizzando piccoli perni metallici posizionati lungo i bordi più esterni, si allarga delicatamente la vescica in modo che il lume sia rivolto verso l'alto e la massima quantità di urotelio sia esposta. Dopo aver eseguito la colorazione LacZ come indicato nel protocollo testuale, osservare gli IBC, che appaiono come punti blu sotto un microscopio dissezionale.