JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologia
0 visualizzazioni • 2:40 min • March 31st, 2026
Inizia con un topo anestetizzato con un coperchio in piastra di Petri posizionato sotto l'addome per mantenere la schiena orizzontale.
Il topo presenta una ferita da ustione sulla schiena che è stata infettata da Acinetobacter baumannii, un patogeno batterico Gram-negativo.
I batteri sono geneticamente modificati per trasportare un operone bioluminescenze.
Posizionare il topo all'interno di una camera di imaging a bioluminescenza mantenuta a una temperatura ottimale e iniziare l'immagini.
Nel sito di infezione, i geni luxA e luxB dell'operone di bioluminescenza codificano per l'enzima luciferasi. I geni luxCDE codificano enzimi che sintetizzano il substrato della luciferasi.
La luciferasi catalizza l'ossidazione del substrato e produce luce visibile, rendendo i batteri luminescenti.
Il segnale di bioluminescenza indica la presenza di batteri metabolicamente attivi nel sito della ferita.
Utilizzando software di imaging, quantifica l'intensità del segnale di bioluminescenza per stimare il carico batterico vitale.
Immediatamente dopo l'inoculazione, esegui l'imaging bioluminescente avviando il software di imaging in tempo reale. Nel pannello di controllo, clicca su Inizializza. Poi aspetta che il colore della scatola della temperatura diventi verde, indicando che la temperatura dello stadio nella camera del campione ha raggiunto i 37 gradi Celsius.
Posizionare il topo anestetizzato sul palco caldo nella camera del campione con le ustioni infette direttamente sotto la telecamera. Poi, nel pannello di controllo, metti un segno accanto a "Luminescenza".
Poi seleziona "Auto esposizione" in modo che il tempo di esposizione per l'imaging venga ottimizzato dal software di imaging live in base all'intensità della bioluminescenza. Seleziona "C" dalla lista a tendina "Campo di Vista". Seleziona l'opzione di scansione a media gamma per lasciare che il software determini la distanza focale.
Poi metti un segno accanto a sovrapposizione. Ora, clicca su "Acquisisci" per catturare l'immagine. Poi, nella casella "Modifica etichetta immagine", clicca ok. Appariranno una "Finestra Immagine" e una "Palette Toll". Imposta i parametri Auto-ROI per la selezione automatica.