JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologia
0 visualizzazioni • 2:15 min • March 31st, 2026
Inizia con le piantine di mais che crescono in condizioni controllate per fungere da ospite.
Poi, prendiamo Agrobacterium tumefaciens, un batterio patogeno delle piante.
I batteri ingegnerizzati portano un costrutto di T-DNA che codifica un genoma virale ricombinante. Questo genoma contiene un frammento genetico inserito progettato per silenziare un gene del mais bersaglio.
Iniettare i batteri appena sopra il nodo coleoptilare, il nodo più basso della pianta, finché la sospensione non riempie il coleottile, assicurando la consegna ai tessuti interni.
Nel sito di iniezione, i batteri trasferiscono il T-DNA che trasporta il genoma virale nelle cellule di mais, dove viene trascritto in RNA virale che si sposta nel citoplasma.
L'RNA si replica e innesca la produzione di proteine virali, formando nuove particelle virali che si diffondono sistemicamente per stabilire l'infezione.
L'RNA virale che trasporta il frammento genetico desiderato attiva la macchina di interferenza RNA della pianta, degradando specifici mRNA di mais e silenziando il gene bersaglio.
Ciò comporta alterazioni visibili nei fenotipi regolati dal gene bersaglio durante la crescita delle piante infette, come la formazione di lesioni necrotiche, confermando il silenziamento genico riuscito.
Usa piantine di mais da 4 a 7 giorni per iniettare Agrobacterium. Assembla la siringa e l'ago. Iniettare delicatamente la sospensione batterica 2-3 millimetri sopra il linfonodo coleoptilulare finché non riempie il coleottile o non è visibile nel verticile, a seconda della fase di crescita delle piante.
Inietta tutte le piantine e cambia la siringa e gli aghi per l'iniezione di ogni costrutto. Confermare l'infezione fenotipica osservando le lesioni dovute al silenziamento dei geni di controllo, mimica della lesione 22 o fitoene desaturasi sulle foglie.