Un dispositivo microfluidico per l'imaging in tempo reale e il monitoraggio della pressione durante la formazione del biofilm

Inizia con un dispositivo microfluidico montato su un palco per microscopio.

Il dispositivo è composto da un assemblaggio polimero-vetro che racchiude un microcanale con pilastri cilindrici che imitano un mezzo poroso.

Una pompa a siringa eroga il mezzo di coltura attraverso una siringa montata con filtro nel canale, che drena tramite un tubo di uscita in un contenitore di rifiuti.

Monitorare la pressione di base del fluido utilizzando un sensore collegato al canale.

Inserire il tubo di uscita in una fiala contenente una sospensione batterica.

Inverti il flusso finché la sospensione non riempie il canale, mentre il filtro impedisce ai batteri di entrare nella siringa.

Incubare per permettere alle cellule batteriche di aderire alle superfici, proliferare e avviare la formazione di biofilm.

Poi, rimuovi il filtro e riporta l'uscita nel contenitore dei rifiuti.

Riprendere il flusso del mezzo e monitorare la pressione mentre il biofilm cresce e blocca il canale.

Cattura immagini microscopiche in time-lapse per visualizzare la crescita del biofilm nel tempo. Correlazione la crescita del biofilm con i cambiamenti di pressione per studiare il bioostruzione nei mezzi porosi.

Inizia accendendo l'incubatore a scatola del microscopio tre ore prima dell'esperimento per garantire una temperatura stabile di 25 gradi Celsius.

Collega il tubo di entrata e uscita al dispositivo microfluidico. Fissa la connessione tra il tubo e la siringa inserendo un ago con un diametro esterno di 0,6 millimetri nel tubo di ingresso. Inserire il dispositivo microfluidico, 30 millilitri di acqua deionizzata e 30 millilitri di mezzo di coltura in un essiccatore a vuoto e degassare per almeno un'ora.

Una volta fatto, tira lentamente il mezzo di coltura e l'acqua deionizzata in due siringhe separate da 30 millilitri. Poi, monta il dispositivo microfluidico sul microscopio e posiziona il tubo di uscita in un contenitore di rifiuti. Collega la siringa piena di acqua deionizzata al canale microfluidico attraverso il tubo microfluidico e inietta lentamente l'acqua fino a esce dall'uscita del sensore di pressione.

Riempi il sensore di pressione con acqua e risciacqua tutte le bolle dal tubo che collega il canale microfluidico al sensore di pressione. Chiudi l'uscita del sensore di pressione con le viti dedicate al sensore di pressione. Riempi il resto del canale microfluidico con acqua deionizzata.

Successivamente, posizionare un filtro da 1,2 micrometri sulla siringa del mezzo di coltura. Rimuovi la siringa ad acqua e collega con attenzione la siringa al tubo microfluidico di ingresso. Dopo aver montato la siringa sulla pompa, risciacqua il canale con il mezzo di coltura a una portata di due millilitri all'ora per un'ora.

Successivamente, imposta la pompa della siringa alla portata desiderata durante l'esperimento e imposta la lettura di pressione dei sensori a zero. Successivamente, una pipetta di 1 millilitro della coltura Bacillus subtilis NCIB 3610 con una densità ottica di 0,1 a una lunghezza d'onda di 600 nanometri in una fiala centrifuga da 1,5 millilitri. Per caricare la coltura batterica nel canale microfluidico, inserire il tubo di uscita nella fiala della centrifuga e attendere cinque minuti per rimuovere eventuali bolle d'aria dall'uscita del tubo.

Una volta terminato, preleva 150 microlitri di soluzione batterica a una portata di 1 millilitro all'ora finché il canale microfluidico non è riempito con la coltura batterica. Poi, rimuovi con attenzione il filtro per la siringa del materiale di coltura e inserisci la presa nel contenitore dei rifiuti. Lasciare le cellule batteriche in condizioni di flusso zero nel canale microfluidico per tre ore per permettere il loro attacco superficiale nel mezzo poroso.

Per iniziare l'esperimento, avvia il flusso impostando la pompa della siringa alla portata desiderata e avvia la lettura della pressione a 1 hertz prima di acquisire le immagini dei biofilm in crescita all'intervallo di tempo, alla configurazione ottica e all'ingrandimento desiderati.