JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Microbiologia
0 visualizzazioni • 2:51 min. • February 26th, 2026
Inizia con una piastra multi-pozzetto contenente cellule epiteliali cancerose aderenti su un copertore.
Aggiungi Shigella flexneri, un batterio patogeno.
Centrifuga la piastra per favorire il contatto batterico con le cellule, poi incuba.
Utilizzando un sistema specializzato di secrezione, Shigella inietta proteine di virulenza nelle cellule epiteliali.
Queste proteine della virulenza modulano il sistema di segnalazione epiteliale, facilitando l'assorbimento batterico.
All'interno delle cellule, i batteri continuano a secernere proteine della virulenza, che interrompono la traduzione cellulare e accumulano mRNA non tradola.
Le proteine di legame e segnalazione dell'RNA si aggregano con gli mRNA non tradotti, formando granuli citoplasmatici privi di membrana noti come granuli di stress.
Scarta il substrato e lava per rimuovere i batteri non attaccati.
Successivamente, aggiungi un substrato di coltura preriscaldato integrato con gentamicina per eliminare i batteri attaccati alla superficie.
Aggiungi un fissativo per preservare le strutture cellulari e i granuli di stress.
Elimina il fissativo e lava con una lieve scuotimento per rimuovere residui di fissativo.
Le cellule sono pronte per la colorazione immunofluorescenza per visualizzare i granuli di stress indotti da Shigella.
Sostituire il lavaggio con 500 microlitri di mezzo infettivo per pozzo e centrifugare la piastra a 24 pozzi per far ruotare i batteri sulle cellule.
Trasferire le cocolture batteriche sedimentate in un incubatore di colture tissutali a 37 gradi Celsius per 30 minuti per facilitare l'infezione delle cellule ospiti.
Al termine dell'incubazione, rimuovere i batteri esogeni dalle cellule con tre risciacqui in 1 millilitro di mezzo fresco per coltura HeLa a 37 gradi Celsius per lavaggio.
Successivamente, copri le cellule infette con 1 millilitro di mezzo fresco contenente gentamicina e riporta la piastra nell'incubatore di colture cellulari.
Dopo un'ora, aspirare completamente il soprantantante e fissare i campioni in 0,5 millilitri di paraformaldeide al 4% a temperatura ambiente in PBS per 30 minuti.
Successivamente, getta il fissativo nel contenitore dei rifiuti appropriato e lava le coperture con 1 millilitro di soluzione fisiologica tamponata per due minuti, scuotendola delicatamente.