Immunocolorazione di microlesioni piene di batteri in una sezione di tessuto cardiaco di topo per l'imaging

Inizia con un vetrino contenente una sezione di tessuto cardiaco fissata chimicamente da un topo infetto da Streptococcus pneumoniae, un batterio patogeno.

Questa infezione provoca la formazione di microlesioni extracellulari piene di batteri all'interno dei muscoli cardiaci.

Lava la sezione con un tampone per rimuovere eventuali residui di fissazione.

Applicare un detersivo non ionico per permeabilizzare le membrane cellulari dell'ospite.

Lava di nuovo per eliminare eventuali residui di detersivo.

Incubare la sezione con un agente bloccante per bloccare i siti di legame non specifici.

Sciacquare per rimuovere l'agente bloccante non legato.

Introdurre un anticorpo primario che si lega al polisaccaride capsulare del batterio.

Lavare per rimuovere qualsiasi anticorpo non legato, poi aggiungere un anticorpo secondario verde marcato con fluoroforio che si lega all'anticorpo primario.

Controcolorare con un colorante nucleare per contrassegnare i nuclei della cellula ospite.

Lava la sezione e montala usando un mezzo di montaggio.

Osserva la sezione usando microscopia confocale per visualizzare i batteri marcati all'interno delle microlesioni.

Utilizzando una sezione cardiaca da 5 micron su vetrine di vetro caricate positivamente, prima congela le sezioni, poi scongelale e lasciale asciugare all'aria. Fissa i vetrini in formalina tamponata al 10% di neutro per 10 minuti a 25 gradi Celsius. Poi, rimuovi il fissativo con tre lavaggi e PBS per cinque minuti per lavaggio.

Segue permeabilizzando il tessuto con Triton X-100 allo 0,2% in PBS per 15 minuti. Rimuovi il detersivo con altre tre lavaggi in PBS puro. Poi, blocca il tessuto con siero di capra al 10% in PBS per un'ora. Dopo un risciacquo in PBS, copri la sezione con antisiero per due ore a 37 gradi Celsius. Tratta i controlli negativi con antisiero per conigli ingenui.

Poiché il tessuto cardiaco assorbe facilmente la colorazione immunofluorescente XI, portando a alti livelli di fondo, probabilmente dovrà ottimizzare la concentrazione nel tempo di incubazione per diversi tipi di anticorpi.

Due ore dopo, lava via l'antisiero con PBS. Poi sostituisci la soluzione con un anticorpo secondario e lascia che le vetrine si incubino a 37 gradi Celsius per altri 30 minuti. Ora, applica DAPI a 5 milligrammi per millilitro e lava le vetrine con PBS. Infine, monta le vetrine in FluorSave e fotografale con microscopia confocale.