Valutazione degli effetti inibitori sulla formazione delle pellicole in Bacillus subtilis

Si inizia con una coltura di Bacillus subtilis, un batterio del suolo, coltivato in un mezzo ricco di nutrienti.

Centrifugare per mettere in pellet i batteri, scartare il surnatante, poi risospendere il pellet in un mezzo chimicamente definito che supporta la formazione di biofilm.

Misura la densità ottica della coltura per determinare la concentrazione batterica appropriata.

Aggiungere la coltura a pozzi contenenti un mezzo definito per il controllo e un mezzo definito con un inibitore per il test.

Incubare in condizioni statiche. I batteri migrano verso l'alto e si accumulano all'interfaccia aria-liquido, dove una maggiore disponibilità di ossigeno favorisce la crescita batterica.

Nel pozzo di controllo, i batteri all'interfaccia secernono componenti della matrice extracellulare e formano un biofilm galleggiante noto come pellicola, uno strato protettivo che migliora la sopravvivenza batterica.

Nel pozzo testato, l'inibitore interrompe la sintesi della matrice, causando la dispersione di popolazioni batteriche.

Questo saggio mostra che gli inibitori bloccano la formazione di biofilm, che è una caratteristica chiave della patogenesi batterica.

Per prima cosa, seleziona una singola colonia adatta e trasferiscila in 3 millilitri di brodo LB. Inserisci questa coltura iniziale in un incubatore a scuotimento per 4 ore a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, prendere 1,5 millilitri di coltura iniziale e centrifugare per quattro minuti.

Rimuovere con attenzione il surnatante, poi risospendere il pellet in 1,5 millilitri di mezzo MSgg. Per far crescere pellicoli, si prepara una piastra di coltura cellulare a 12 pozzi aggiungendo 3 millilitri di MSgg a ciascun pozzo. Ad alcuni di questi pozzi, si aggiunge MSgg con un inibitore a piccole molecole in un intervallo di concentrazione, distribuendo la posizione delle diverse concentrazioni intorno alla piastra per evitare effetti di bordo.

Misurare la densità ottica a 600 nanometri della coltura starter risospesa. La cultura dovrebbe essere compresa tra 0,6 e 1. Questo è fondamentale per la robustezza del sistema.

Inoculare ogni pozzetto della piastra di coltura con 3 microlitri della coltura starter sosspesa. Poi, incubare la piastra a 23 gradi Celsius per tre giorni in condizioni statiche. Successivamente, rimuovi la piastra dall'incubatrice e osserva le pellicole da scatto.