JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologia
0 visualizzazioni • 2:32 min • February 26th, 2026
Incubare un coverglass a camera contenente batteri aderiti in un mezzo integrato con filtrato di sputo, derivato dal paziente, e solo nel mezzo.
Il filtrato di spettorato contiene componenti derivati dall'ospite che stimolano le vie di segnalazione batterica, innescando la produzione della matrice e la formazione di biofilm.
Una volta formati i biofilm, si scarta il mezzo contenente batteri liberi e componenti residui derivati dall'ospite.
Lava con un tampone per rimuovere i batteri attaccati debolmente.
Aggiungi una miscela colorante contenente coloranti fluorescenti permeabili alla membrana e impermeabili alle membrane, e incuba al buio.
Il colorante permeabile alla membrana attraversa membrane intatte, segnando sia batteri vitali che non vitali. Al contrario, il colorante impermeabile entra solo nelle membrane danneggiate, etichettando selettivamente i batteri non vitali.
Dopo l'incubazione, rimuovere la soluzione di colorazione e lavare con il tampone per eliminare il colorante in eccesso e ridurre la fluorescenza di fondo.
Aggiungi nuovo mezzo e acquisisci immagini usando microscopia confocale.
I biofilm coltivati con filtrato di espettoro mostrano uno spessore aumentato, evidenziando il ruolo dei componenti derivati dall'ospite nella formazione dei biofilm.
Dopo la crescita, rimuovere il substrato dai pozzi della camera e lavare delicatamente ogni camera due volte con 300 microlitri di PBS sterile.
Successivamente, per preparare la miscela di colorazione per il biofilm, aggiungi 1 microlitro di ogni colorante fornito nel kit di vitalità a ogni millilitro di soluzione necessaria e mescola la soluzione.
La quantità ottimale di colorante e il tempo di colorazione sono determinati empiricamente per ogni organismo.
Aggiungi 200 microlitri della miscela di colorazione in ogni pozza del vetro di copertura a camera. Incuba il vetro di copertura.
Dopo l'incubazione, rimuovere la miscela di colorazione dalle camere e lavare ogni pozzo con 300 microlitri di PBS sterile.
Sostituisci il PBS con un supporto nuovo. Infine, procedere con la visualizzazione tramite microscopia confocale.