JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologia
0 visualizzazioni • 2:59 min • March 31st, 2026
Si inizia con pozzi a microplacche contenenti biofilm di un batterio patogeno, suddivisi in quattro gruppi sperimentali.
Aspirare delicatamente il substrato e risciacquare con un tampone per rimuovere le cellule non aderenti.
Aggiungere un buffer contenente un precursore del fotosenziatore a due gruppi, mentre i restanti due ricevono solo il buffer.
Incubare tutti i gruppi al buio per permettere al precursore di diffondersi attraverso il biofilm, entrare nelle cellule batteriche e metabolizzarsi in un fotosensibilizzatore che si accumula nel citoplasma e nelle membrane.
Dopo l'incubazione, esporre un gruppo trattato con precursore e un gruppo solo tampone all'irradiazione luminosa.
Nel gruppo trattato con precursori, la luce eccita il fotosensibilizzatore, che trasferisce energia all'ossigeno molecolare e genera specie reattive di ossigeno (ROS).
Gli ROS disturbano le membrane, degradano proteine e frammentano il DNA, causando la morte cellulare batterica.
Le altre tre condizioni non producono ROS, poiché o il precursore o la luce sono assenti, lasciando il biofilm intatto.
Per generare un biofilm in una piastra da 96 pozzi, prima inoculare uno a meno 80 gradi Celsius ha scongelato Staphylococcus aureus USA trecento in tre biofilm, formando colture di ceppi clinici in singoli tubi da 14 millilitri a fondo rotondo contenenti cinque millilitri di brodo di soia triptonica, o TSB, medium, in un incubatore a 37 gradi Celsius con agitazione durante la notte. Quando le colture raggiungono la fase stazionare, centrifugare le cellule batteriche e risospendere i pellet e il PBS a 2 per 10 alla nona colonia, formando unità per concentrazione di millilitri. Diluire queste sospensioni batteriche in un rapporto 1 a 200 e un mezzo TSB integrato con glucosio zero virgola cinque percento e seminare 200 microlitri di cellule batteriche per pozzo in tre pozzi per ceppo per gruppo sperimentale in una micropiastra di 96 pozzi trattata con coltura di cellule di polistirene per un'incubazione di 24 ore a 37 gradi Celsius, con ossigeno, senza tremare.
Il giorno dopo, lavare delicatamente i pozzi tre volte con PBS senza disturbare i biofilm. Successivamente, aggiungi 200 microlitri di ALA appena preparato ai pozzi sperimentali appropriati e posiziona la piastra a 25 gradi Celsius per un'ora protetta dalla luce. Poi irradia la piastra con un diodo luminoso a un'intensità luminosa di 100 milliwatt per centimetro quadrato per un'ora.