Preparazione del campione e imaging di batteri marcati con fluorescenza

Inizia con una grande vetrina di vetro con vetrine più piccole posizionate su ciascun bordo in un doppio strato.

Versa agarosio fuso nello spazio e coprilo con un altro grande vetrino di vetro.

Raffredda il setup per solidificare l'agarosio.

Rimuovi i vetri e taglia l'agarosio in piccoli cuscinetti.

Metti i cuscinetti di agarosio all'interno di una cornice adesiva fissata a una carrella.

Prendi una coltura di batteri patogeni, geneticamente modificati per esprimere un sistema di secrezione marcato fluorescente, essenziale per l'infezione dell'ospite.

Usa una chiazza batterica densa e sospesa in acqua.

Vortice per disperdere i batteri in modo uniforme.

Applica la sospensione sul cuscinetto di agarosio per immobilizzare i batteri.

Sigilla con una copertura per mantenere l'idratazione.

Sotto illuminazione a campo chiaro, seleziona un campo di celle per l'immagini.

Ottimizzare le impostazioni del microscopio per ridurre il fotosbiancamento e aumentare la sensibilità del segnale.

Passa al canale di fluorescenza per rilevare i batteri con marcatura fluorescente.

Inizia realizzando cuscinetti di agarosio per l'imaging delle cellule vive. Prepara circa 30 millilitri di soluzione di agarosio a bassa fumatura all'1% in acqua e cuocoli al microonde in una fiaschetta di vetro per circa 90 secondi, facendo roteare di tanto in tanto finché l'agarosio non si dissolve completamente.

Posizionare due vetrini di vetro da 22 x 22 x 0,15 millimetri sul bordo di un vetrino di vetro da 25 x 75 x 1,1 millimetri, uno sopra l'altro. Poi, impila altre due delle slide più piccole sull'altro bordo. Pipetta circa 1 millilitro di agarosio fuso nel vetrino centrale tra i due vetri superiori e posiziona un altro grande vetrino sopra l'agarosio fuso, assicurandosi di evitare la formazione di bolle d'aria.

Raffredda i vetri a quattro gradi Celsius per 15 minuti, poi usa un bisturi o una lametta per tagliare delicatamente il tampone in piccoli quadrati. Fissa un telaio adesivo a doppia faccia su un carrello di vetro da 25 x 75 x 1,1 millimetri e posiziona diversi cuscinetti sul carrello. Sciogliere una pesante chiazzetta di Legionella pneumophila in 1 millilitro di acqua doppiamente distillata.

Poi vortice e pipetta 2-3 microlitri di diluizione sui tamponi. Posiziona delicatamente un copricapo da 58 per 24 per 0,15 millimetri sopra il telaio adesivo. Seleziona le cellule per l'imaging utilizzando l'illuminazione in campo intenso.

Poi, nella finestra di cattura del software del microscopio, regola il ND a 180 e il binning a 2 per 2. Utilizzare il canale da 488 nanometri per esporre il campione per 500-1000 millisecondi e convalidare la specificità della fluorescenza tramite immagini di Legionella pneumophila non marcata con gli stessi parametri.