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Si inizia con un topo il cui tratto gastrointestinale è colonizzato da Clostridium difficile, un patogeno batterico anaerobico che forma spore.
Immobilizza il topo e lascialo defecare naturalmente in un tubo sterile pre-pesato.
Determinare il peso netto del campione fecale sottraendo il peso del tubo vuoto dal peso totale per preparare le diluizioni appropriate.
Trasferire il campione in un ambiente anaerobico per preservare la vitalità del batterio sensibile all'ossigeno.
Aggiungi un buffer al campione e interrompilo meccanicamente per liberarne il contenuto in sospensione.
Incubare per permettere a detriti più grandi di depositarsi, trattenendo cellule batteriche e spore nel soprandante.
Eseguire diluizioni seriali del sovrantante nel buffer.
Impiattare le diluizioni su un mezzo selettivo e incubare in condizioni anaerobiche.
Il mezzo favorisce la germinazione delle spore e la crescita selettiva di Clostridium difficile mentre inibisce batteri concorrenti, risultando in colonie distinte.
Contare le colonie per quantificare il carico di Clostridium difficile nelle feci e valutare la colonizzazione gastrointestinale.
Per raccogliere campioni fecali dai topi per la valutazione, si trattiene prima leggermente ma con fermezza il topo soggetto per la pelle rilassata sul collo e sulla schiena, assicurandosi che l'animale non sia in difficoltà.
Con il mignolo, solleva delicatamente la coda dell'animale, esponendo l'ano. Tieni un tubo microcentrifuga sterile di peso noto direttamente sotto l'ano dell'animale, assicurandoti che il tubo non tocchi direttamente il topo. Quando l'animale defeca, raccogli il pellet fecale nel tubo.
Conserva il tubo a temperatura ambiente fino a quando non vengono raccolti tutti i campioni necessari. Pesa i tubi contenenti feci su una bilancia analitica e registra la massa fino a quattro decimali. Calcola il peso della pallina fecale sottraendo il peso del tubo.
Successivamente, calcola una diluizione da uno a dieci del contenuto e risospendi in 1x PBS. Usa la punta della pipetta per disgregare delicatamente le feci in soluzione. Incubare i campioni a temperatura ambiente per 30 minuti, lasciando che il contenuto si depositi.
Mantenendo le soluzioni in modo anaerobico, effettuare diluizioni seriali per ogni campione in 1x PBS. Trasferire 100 microlitri di ogni diluizione seriale su lastre TCCFA. Usa uno sparpagatore sterile a forma di L e applica uniformemente il substrato sulle lastre.
Incubare le placche in condizioni anaerobiche a 37 gradi Celsius per 24 ore. Infine, enumerare le colonie di C. difficile e calcolare l'unità formatrice della colonia per grammo di contenuto fecale.