JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologia
0 visualizzazioni • 3:03 min • March 31st, 2026
Prendi una coltura batterica capace di infettare il tessuto fogliare.
Raschia le colonie e sospendi in una soluzione salina.
Misura la densità ottica per valutare la concentrazione batterica, poi diluisci fino al diametro diametro desiderato.
Eseguire diluizioni seriali per raggiungere la concentrazione finale dell'inoculo.
Aggiungi un tensioattivo per ridurre la tensione superficiale e garantire una diffusione uniforme dei batteri sulla foglia.
Trasferire la sospensione in una piastra di Petri.
Poi, posiziona due bastoncini di legno sopra un vaso di Arabidopsis .
Inverti la pianta sopra il piatto, immergendo le foglie nella sospensione.
Posiziona l'impianto in una camera a vuoto e applica un impulso di vuoto
Il vuoto applicato rimuove l'aria dal tessuto fogliare attraverso aperture naturali.
Rilasciare il vuoto ripristina la pressione atmosferica, costringendo i batteri a entrare nelle foglie.
Ripeti gli impulsi per ottenere la massima infiltrazione.
Togli il pentoiere. Poi asciuga l'inoculo in eccesso.
Le foglie di Arabidopsis infettate da batteri sono pronte per l'analisi a valle.
Stira il stock di glicerolo del ceppo di interesse di Pseudomonas syringae da meno 80 gradi Celsius in una piastra LB integrata con gli antibiotici appropriati. Incubare la piastra a 28 gradi Celsius per 40-48 ore. Raschiare la biomassa batterica e risospenderla in cinque millilitri di cloruro di magnesio da 10 millimolari.
Misura la densità ottica a 600 nanometri e aggiustala a 0,1 aggiungendo 10 millimolari cloruro di magnesio. Eseguire diluizioni seriali in cloruro di magnesio a 10 millimolari per ottenere una concentrazione finale di inoculo di 5 volte 10 al quinto CFU per millilitro. Poi, prepara 200 millilitri di inoculo per le piante di Arabidopsis e 50 millilitri per le piante di fagioli.
Prima dell'inoculazione, aggiungere il tensioattivo Silwet L-77 a una concentrazione finale dello 0,02% per l'inoculazione dei fagioli e dello 0,01% per Arabidopsis. Per l'infiltrazione da Arabidopsis , posizionare due bastoncini di legno a forma di X sopra il vaso e posizionare il vaso rivolto verso il basso sopra una piastra di Petri di 14 centimetri di diametro contenente 200 millilitri di inoculo. Per l'inoculazione delle foglie di fagiolo, inserire le piante e la soluzione dell'inoculo in una camera a vuoto e introdurre la foglia in un tubo centrifugo conico da 50 millilitri contenente l'inoculo.
Dai un impulso di 500 millibar per 30 secondi per infiltrarti nelle foglie. Drenare la soluzione in eccesso di inoculo con un foglio di carta e riportare le piante nella corrispondente camera di crescita.