JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Microbiologia
0 visualizzazioni • 2:00 min. • March 31st, 2026
Inizia con cellule cianobatteriche fisse, immobilizzate e permeabilizzate aderite a una copertura.
Queste cellule cianobatteriche esprimono proteine regolatrici della crescita a bassa abbondanza.
Durante l'imaging a fluorescenza ad alta risoluzione, i pigmenti sensibili alla luce naturali all'interno delle cellule cianobatteriche emettono fluorescenza di fondo.
Questo riduce la qualità dell'immagine quando si visualizzano queste proteine a bassa abbondanza.
Per minimizzare questa fluorescenza di fondo, si posiziona il copertore contenente le cellule cianobatteriche in un piatto di colorazione.
Aggiungere un tampone bloccante contenente proteine sierie per prevenire il legame anticorpale non specifico durante il processo a valle e un detersivo per mantenere la permeabilità cellulare.
Metti la teglia di colorazione sul ghiaccio ed esponi le cellule a una luce intensa allo xeno.
La luce ad alta intensità avvia il fotosbiancamento, degradando i pigmenti fotosensibili, mentre le proteine a bassa abbondanza che regolano la crescita rimangono inalterate.
Le condizioni fredde minimizzano i danni causati dal calore e preservano l'integrità cellulare.
Questo processo consente una visualizzazione chiara di proteine a bassa abbondanza che regolano la crescita tramite immunocolorazione durante la microscopia a fluorescenza ad alta risoluzione.
Trasferisci il copertino lavato nella piastra di verniciatura.
Aggiungi 50 microlitri di buffer di blocco sulla parte superiore del copertino. Metti l'intero piatto di colorazione sul ghiaccio e poi spostalo sotto la sorgente di luce allo xeno per il fotosbiancamento per almeno 60 minuti. Dopo la fotosbiancatura e il blocco, usa il bordo di un asciugamano di carta per rimuovere il buffer di bloccaggio.