JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Microbiologia
0 visualizzazioni • 3:46 min. • March 31st, 2026
Inizia con campioni batterici pretrattati con concentrazioni crescenti di un antibiotico che elimina i batteri suscettibili.
Aggiungi un mezzo di crescita contenente ossido di deuterio e la stessa concentrazione di antibiotico ai tubi corrispondenti.
Incubare i tubi in condizioni di scuotere.
L'ossido di deuterio entra nelle cellule batteriche, dove il deuterio viene incorporato nelle biomolecole appena sintetizzate, formando legami carbonio-deuterio.
Centrifuga i batteri, elimina il soprantantante e lava il prodotto.
Aggiungi un fissativo per preservare la struttura batterica.
Aggiungi acqua, centrifuga e rimuovi il surnadante.
Risospendi i batteri e trasferisci la sospensione su un vetro di copertura rivestito in poli-L-lisina, poi sigillalo.
Posizionare il campione sul palco di un microscopio Raman a scattering stimolato pre-calibrato o SRS. Aggiungi acqua e abbassa l'obiettivo.
Acquisire immagini di più campi per valutare la frequenza vibrazionale carbonio-deuterio.
A concentrazioni più elevate di antibiotici, il segnale carbonio-deuterio diminuisce, indicando una diminuzione della vitalità batterica.
Ciò consente una valutazione rapida della suscettibilità agli antibiotici correlando l'intensità del segnale SRS con la vitalità batterica.
Dopo 1 ora di incubazione, aggiungere 700 microlitri di antibiotico diluito serialmente con mezzo MHB contenente 100% di deuterio ai 300 microlitri di batteri antibiotici pre-trattati nella stessa concentrazione di antibiotici. Omogeneizzare la miscela pipettando su e giù più volte. Aggiungere 700 microlitri di mezzo senza antibiotici al 100% deuterio contenente MHB a 300 microlitri di batteri privi di antibiotici come controllo positivo.
Aggiungere 700 microlitri di deuterio senza antibiotici contenente MHB a 300 microlitri di batteri privi di antibiotici come controllo negativo. Incubare tutti i microtubi a 37 gradi Celsius e 200 rotazioni al minuto per 30 minuti. Dopo l'incubazione, centrifugare il campione di 1 millilitro di antibiotico e batterio trattato con deuterio a 6.200 volte g per 5 minuti a 4 gradi Celsius. Poi, lava il pellet due volte con acqua purificata. Fissare i campioni in una soluzione di formalina al 10% volume per volume e conservarli a 4 gradi Celsius.
Per la preparazione del campione, lavare 1 millilitro di soluzione batterica fissata con acqua purificata e centrifugare la soluzione batterica lavata a 6.200 volte g per 5 minuti a 4 gradi Celsius.
Rimuovere il soprandanante e arricchire la soluzione batterica a circa 20 microlitri con acqua sterilizzata. Depositare la soluzione batterica su un vetro di copertura rivestito in poli-L-lisina, mettere un sandwich con un altro vetro di copertura e sigillare il campione. Metti il campione batterico sulla fase di campionamento sotto l'obiettivo di immersione in acqua 60x. Inizia l'imaging SRS di campioni batterici. Visualizza almeno tre campi visivi per ogni campione.