JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Microbiologia
0 visualizzazioni • 2:36 min. • March 31st, 2026
Prendi una sospensione di un batterio patogeno isolato da una pianta infetta.
Il genoma batterico contiene una fusione trascrizionale, in cui il promotore di un gene regolatore della virulenza guida anche l'espressione di un gene proteico fluorescente a valle e privo di promotore.
Durante l'infezione delle piante, l'attivazione del promotore innesca la produzione delle proteine regolatorie e fluorescenti.
La proteina regolatoria attiva i geni della virulenza, mentre la fluorescenza fornisce una lettura misurabile dell'attivazione della virulenza.
Centrifugare le celle, scartare il surnante, poi risospendere per ottenere una sospensione concentrata.
Posiziona una goccia su una copertura e sovrappone un tampone di agaroso per diffondere e immobilizzare le cellule.
Cattura un'immagine in campo chiaro per identificare tutte le cellule batteriche, poi un'immagine di fluorescenza per rilevare la fluorescenza di singola cellula.
Unisci entrambi per visualizzare differenze di intensità di fluorescenza, che rivelano sottopopolazioni con alta, bassa o nessuna espressione genica di virulenza.
Questa variazione fenotipica riflette una strategia adattativa che migliora la sopravvivenza batterica durante la colonizzazione delle piante.
Per un'analisi a singola cellula, preparare una soluzione di agarosio all'1,5% in acqua distillata. Una volta fusa, aggiungi abbastanza volume da riempire lo spazio tra due vetrine di microscopia affiancate e posiziona un'altra vetrina sopra. Lasciali guidare per 15 minuti e rimuovi con cura il carrello posizionato sopra.
Usando una lama, taglia il tampone di agarosio in pezzi da 5 millimetri per 5 millimetri prima dell'uso. Parallelamente, centrifuga 1 millilitro del batterio estratto dall'apoplasto. Rimuovere con cura il soprantantante con una pipetta e risospendere il pellet in 20 microlitri d'acqua per concentrare le cellule.
Posiziona una goccia di 2 microlitri delle celle concentrate su un copritore da 0,17 millimetri e copri la goccia con un pezzo di tampone di agarosio. Visualizza la preparazione batterica sotto il microscopio confocale per identificare i batteri fluorescenti verdi usando laser specifici. Identifica tutti i batteri usando il campo chiaro e unisci entrambi i campi.