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Inizia con piccoli frammenti di tessuto fogliare raffreddato in cui il floema è infettato da un patogeno batterico.
Inserire i pezzi in una malta con azoto liquido per inibire l'attività delle nucleasi degradanti il DNA.
Macinare per disturbare meccanicamente le cellule e liberare componenti intracellulari.
Usa una spatola raffreddata per trasferire la polvere, aggiungi il tampone di lisi e trasforma la sospensione in un vortice.
Incubare per lisare nuclei vegetali e cellule batteriche, rilasciando DNA e RNA mentre denaturano le proteine.
Aggiungi RNasi e incuba per degradare l'RNA.
Aggiungi un tampone di precipitazione proteica alle proteine aggregate, poi centrifuga per separarle.
Trasferire il DNA vegetale e batterico contenente il sovrandanante in isopropanolo per precipitare il DNA come filamenti filiformi.
Centrifuga per raccogliere DNA e scartare il soprantantante.
Lava con etanolo, poi centrifuga e scarta il soprantantante.
Asciuga il DNA all'aria, poi aggiungi un tampone di reidratazione e incuba per scioglierlo.
I campioni di DNA sono ora pronti per la rilevazione a valle di patogeni basata su PCR.
Usa forbici pulite per tagliare una foglia intera e fresca da un albero di agrumi e mettila in un sacchetto di plastica pulito per panini. Poi, raffredda un mortaio aggiungendo una piccola quantità di azoto liquido. Successivamente, usa le forbici per tagliare piccoli pezzi di tessuto fogliare, di circa un pollice quadrato.
Metti i pezzi di foglie nella malta per congelarli immediatamente. Inizia rapidamente a macinare il tessuto fogliare con la malta finché l'azoto liquido non evapora e rimane una polvere verde fine. Successivamente, raffredda una spatola di metallo in azoto liquido per 10-15 secondi. Poi usa la spatola fredda per prelevare il tessuto macinato dalla malta in un tubo micro-centrifuga da 1,5 millilitri. Usa una pipetta da 1000 microlitri per aggiungere 600 microlitri di soluzione di lisi dei nuclei al campione. Poi vortice il campione per uno o tre secondi. Incubare il tubo a 65 gradi Celsius, in un bagno d'acqua per 15 minuti.
Terminato il periodo di incubazione, si utilizza una pipetta da 10 microlitri per aggiungere 3 microlitri di soluzione RNasi al lisato e rimuovere l'RNA. Poi, mescola il contenuto del tubo invertendolo da due a cinque volte. Incubare a 37 gradi Celsius per 15 minuti in un incubatore a armadietto. Dopo 15 minuti, aggiungi 200 microlitri di soluzione di precipitazione proteica al campione. Vortice il tubo ad alta velocità per 20 secondi.
Successivamente, centrifuga il campione a 13000 g per 3 minuti. Durante la centrifugazione, aggiungere 600 microlitri di isopropanolo mantenuti a temperatura ambiente in un nuovo tubo micro-centrifuga da 1,5 millilitri. Dopo la centrifugazione, rimuovere con cura il sovrantantante dal tubo della centrifuga verso quello contenente isopropanolo. Scarta la pallina.
Inverti il tubo affinché il DNA sia visibile come un filo filatore. Successivamente, centrifuga il campione a 13000 g per un minuto a temperatura ambiente.
Decantare il sovrantato dopo la centrifugazione. Poi, aggiungi 600 microlitri di etanolo al 70% al pellet. Inverti il tubo più volte per lavare il pellet. Centrifuga il tubo a 13000 g per 1 minuto. Dopo la centrifugazione, aspirare con cura il soprantantante. Poi, inverti il tubo con il coperchio aperto su una carta assorbente per farlo asciugare all'aria per 15 minuti. Una volta essiccato, aggiungi 100 microlitri di soluzione di reidratazione del DNA al pellet. Incuba la sospensione di DNA a 65 gradi Celsius in un bagno d'acqua per un'ora.