Micro-Parallel Plate Flow Chamber Model for Studying Bacterial Adhesion to Human Endothelial Cells
JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologia
0 visualizzazioni • 3:10 min • July 1st, 2026
Take a gelatin-coated coverslip and seed it with human primary endothelial cells. Incubate to allow cell adherence and proliferation.
Place the coverslip at the base of a micro-parallel plate flow chamber.
Attach the upper parts of the chamber.
Connect the inlet to a syringe filled with a calcium ionophore solution.
Perfuse the chamber with the solution.
The ionophore binds to calcium ions and transports them across the membrane, increasing intracellular calcium levels.
This triggers the release of a vesicle containing the von Willebrand factor (VWF), a glycoprotein.
VWF forms elongated strings on the cell surface under flow conditions.
Now, perfuse fluorescently labeled bacteria through the inlet to apply a fluid flow that mimics shear stress in blood vessels.
The bacteria bind to VWF via surface adhesins.
Wash with a buffer to remove unbound bacteria.
Using fluorescence microscopy, image and quantify bacterial adhesion to the host cells.
For experiments with endothelial cells, coat plastic slips with one milliliter of a 1% gelatin solution in PBS and incubate them for 30 minutes at 37 degrees Celsius.
Then, seed human umbilical vein endothelial cells on the gelatin-coated plastic slips and grow them to 70 to 80% confluency. Mount the endothelial cell-coated plastic slip in the bottom part of the flow chamber. Then, connect the inlet and outlet tubing to the upper part of the flow chamber and connect the outlet tubing to a waste container.
Gently place the upper part of the flow chamber on the bottom part and assemble the flow chamber while avoiding the formation of air bubbles. Inject one milliliter of medium through the chamber to make sure that the chamber is not leaking and to remove excess coating solution.
Next, set up the infusion pump for a one milliliter syringe so that it flows at 75 microliters per minute. Working in a dark room, fill a one milliliter syringe with one milliliter of fluorescently labeled bacteria and place it into the infusion pump. Connect the outlet of the syringe to the inlet of the flow chamber.
Taking care to avoid air bubbles, start the infusion pump for 10 minutes at 75 microliters per minute. After 10 minutes, remove the first syringe and connect a one milliliter syringe containing PBS or DMEM to the inlet tube. Start the infusion, pump, and rinse for 10 minutes to wash away any unbound bacteria.
Once rinsed, leave the infusion pump on and take at least 15 black and white images using an exposure time of 1.5 seconds in random locations, spread over the coated surface of the flow chamber.
Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo dettagliato per lo studio dell'adesione batterica alla parete vascolare in condizioni di flusso, mediante una camera a flusso a piastre parallele di dimensioni micrometriche seminata con cellule endoteliali primarie umane. Il metodo consente la visualizzazione e la quantificazione delle interazioni batteriche con l'endotelio, simulando lo sforzo di taglio fisiologico presente nei vasi sanguigni.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Microbiologia
- Biologia cellulare
- Biologia vascolare
Sfondo
- L'adesione batterica all'endotelio vascolare è un passaggio fondamentale nella patogenesi di molte infezioni.
- Le condizioni di flusso a taglio nei vasi sanguigni influenzano le interazioni tra ospite e patogeno.
- Il fattore di von Willebrand (VWF) viene rilasciato dalle cellule endoteliali e può mediare il legame batterico.
- I modelli in vitro sono essenziali per analizzare i meccanismi di adesione batterica in condizioni controllate.
Scopo dello studio
- Sviluppare e dimostrare un modello riproducibile in vitro per lo studio dell'adesione batterica alle cellule endoteliali in condizioni di flusso.
- Visualizzare e quantificare l'interazione tra batteri e FVW sulle cellule endoteliali attivate.
- Riprodurre condizioni fisiologiche di stress da taglio presenti nei vasi sanguigni.
Metodi Utilizzati
- Rivestimento di coprioggetti o lamelle di plastica con gelatina per supportare la crescita delle cellule endoteliali.
- Seeding e coltura di cellule endoteliali primarie umane (ad esempio, HUVECs) fino a confluenza.
- Assemblaggio di una camera di flusso microfluidica a piastre parallele con lamelle rivestite di cellule endoteliali.
- Perfusione con un ionoforo del calcio per attivare le cellule endoteliali e indurre il rilascio di VWF.
- Perfusione di batteri marcati con fluorocromo attraverso la camera in condizioni di flusso controllato (75 µL/min per 10 minuti).
- Lavaggio con tampone per rimuovere i batteri non legati.
- Microscopia a fluorescenza per acquisire immagini e quantificare i batteri aderenti.
Risultati principali
- Attivazione efficace delle cellule endoteliali e rilascio del fattore di von Willebrand (VWF) in condizioni di flusso.
- Formazione di filamenti di VWF sulla superficie endoteliale, che forniscono siti di legame per i batteri.
- Batteri marcati con fluorescenza aderiscono al VWF mediante adesine di superficie in presenza di stress di taglio.
- L'imaging quantitativo consente la valutazione dell'adesione batterica in diverse posizioni sulla superficie della camera.
Conclusioni
- Il modello descritto simula efficacemente l'adesione batterica alla parete vascolare in condizioni di flusso fisiologico.
- Permette lo studio dettagliato delle interazioni tra ospite e patogeno che coinvolgono il fattore di von Willebrand (VWF) e gli adesini batterici.
- Questo approccio può essere adattato a diverse ceppi batterici e tipi di cellule endoteliali per indagare i meccanismi di infezione vascolare.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La modellizzazione dell'adesione batterica alle cellule endoteliali umane in condizioni di flusso fisiologico è fondamentale per ridurre i rischi associati alle ipotesi iniziali sui bersagli anti-infettivi e per chiarire i meccanismi di interazione ospite-patogeno. Questo sistema di camera a flusso microfluidica a piastre parallele consente una valutazione quantitativa e riproducibile degli eventi di legame batterico, supportando la previsione nei modelli di infezione vascolare. L'approccio guida le decisioni strategiche fornendo dati traslazionalmente rilevanti sui meccanismi di adesione e sui punti di intervento terapeutico.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'analisi meccanicistica dei percorsi di adesione batterica sotto stress di taglio controllato.
- Supporta la validazione funzionale di bersagli dell'ospite e del patogeno coinvolti nella colonizzazione vascolare.
- Fornisce dati quantitativi per ridurre i rischi associati a strategie terapeutiche anti-adesione.
- Facilita il triage di bersagli candidati in base ai fenotipi di adesione.
Sviluppo di screening e saggi
- Stabilisce un saggio standardizzato e riproducibile per la quantificazione delle interazioni batterio-endoteliali.
- Fornisce risultati quantitativi robusti, adatti per lo screening comparativo di ceppi batterici o inibitori.
- Consente la scalabilità del saggio e il riutilizzo della piattaforma per diverse combinazioni ospite-patogeno.
- Supporta lo screening successivo di composti antiadesivi o prodotti biologici.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea i dati di adesione in vitro a modelli vascolari rilevanti per la malattia.
- Fornisce continuità dalla scoperta alla validazione preclinica di strategie anti-infettive.
- Permette un avanzamento dei candidati mirato ai meccanismi di infezione vascolare, adeguato al rischio.
- Supporta l'identificazione di biomarcatori per studi traslazionali sulle interazioni ospite-patogeno.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo modello si inserisce nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica, consentendo la verifica di ipotesi, lo sviluppo di saggi e la validazione traslazionale dei meccanismi di adesione batterica.
- Biologia della scoperta: Supporta l'analisi basata su ipotesi di percorsi di adesione e interazioni ospite-patogeno.
- Screening: Fornisce letture quantitative e riproducibili dell'adesione per la valutazione dei candidati.
- Analisi: Permette il confronto statistico dell'adesione in condizioni definite di flusso e attivazione.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati ottenuti in vitro a modelli preclinici di infezione vascolare.
- Riutilizzo aziendale: Offre una piattaforma modulare adattabile a diversi tipi di cellule endoteliali e batteriche.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi e nella riduzione del rischio meccanicistico delle vie di adesione.
- Valore operativo: Fornisce flussi di lavoro sperimentali standardizzati, riproducibili e scalabili.
- Valore strategico: Orienta le decisioni di avanzamento o interruzione e riduce il rischio biologico in fase avanzata nei portafogli di agenti anti-infettivi.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei candidati mirati all'adesione vascolare in base a un'analisi del rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella coltura cellulare di cellule endoteliali e nell'uso della camera a flusso.
- Necessita di microscopia a fluorescenza e di infrastrutture per l'analisi quantitativa delle immagini.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per l'allestimento del saggio e l'analisi dei dati.
- Adattabile a diverse ceppi batterici e fonti di cellule endoteliali, come indicato dal protocollo.
- Limitato alla modellizzazione in vitro; la complessità fisiologica potrebbe richiedere una validazione complementare in vivo.
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Ultimo aggiornamento: 22 agosto 2026