Name: Dissezione di Human Elements corpo vitreo per lanalisi proteomica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-23T17:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 5 s
Description: Impara la dissezione del corpo vitreo umano per analisi proteomica. Questa tecnica permette di isolare l'ialoide anteriore, la base vitrea e la corteccia con strumenti di precisione.

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Il finanziamento è stato fornito da Lotta per la vista. I tessuti sono stati ottenuti dalla Banca degli occhi Lions Iowa.

1. Segmento dissezione anteriore. <ol><li> La cornea viene rimosso facendo prima un'incisione al limbus, in camera anteriore con una lama di 15 ° (Figura 1). Poi una lama ricurva di cornea-sclerale forbici viene inserito nella camera anteriore. Circonferenziale tagli sono fatti a cornea, appena anteriormente al limbus. </li><li> 0,12 Colibri pinze e forbici Westcott sono usati per tagliare l'iride circonferenza anteriore del corpo ciliare. </li><li> Il nucleo dell'obiettivo sia stato rimosso con pinza 0,12 Colibri o una lama di 15 ° (supersharp) e la corteccia e la capsula con le pinze. </li></ol> 2. Nucleo aspirazione vitreo. <ol><li> Un 23-gauge a 5-cc siringa è inserita nella metà del vitreo (Figura 1). </li><li> Circa 1 ml o più di nucleo vitreo è delicatamente aspirato. </li><li> Il campione viene quindi posto in una provetta per microcentrifuga e poi in azoto liquido. </li></ol> 3. Anteriore Hyaloid Dissection. <ol><li> Il hyaloid anteriore è visto come un semi-anello trasparente regolando la luce incidente da una luce microscopio collo d'oca. Aspirazione precedente del nucleo vitreo separa il hyaloid anteriore da altre strutture per una più facile identificazione. </li><li> Il foglio di tessuto elastico viene accuratamente tirato fuori dal corpo ciliare con Colibri o pinze spogliatoio e tagliato con le forbici Vännäs. Questa manovra viene ripetuta. </li><li> Il campione viene quindi posto in una provetta per microcentrifuga e poi in azoto liquido. </li></ol> 4. Base Dissection vitreo. <ol><li> Utilizzando 0,12 pinze per stabilizzare l'oculare, forbici Westcott sono usati per "fiore" l'occhio facendo quattro equidistanti antistress tagli dal corpo ciliare verso la testa del nervo ottico. </li><li> La pars plicata del corpo ciliare (Figura 2) viene rimosso da ciascuno dei quadranti con le forbici Westcott. </li><li> La base del vitreo viene poi afferrato su entrambi i lati della serrata con una pinza il pars plana e la retina (Figura 2). </li><li> Trazione continua sulla base del vitreo è applicato con le pinze. Taglio sequenziale con le forbici Westcott estratti di un semi-trasparente tessuto con un aspetto "filo di perle", come viene asportato. </li><li> Il campione viene quindi posto in una provetta per microcentrifuga e poi in azoto liquido. </li></ol> 5. Cortex rimozione vitreo. <ol><li> La pars plana è asportato da ciascuno dei quadranti Westcott con le forbici, tagliando il foglio di circa 3 mm posteriormente al serrata (Figura 2). </li><li> Tra i volantini dei tessuti, la corteccia vitreo è visualizzato come una pellicola semi trasparente. </li><li> Il film elastico può essere afferrato con pinze 0,12 o detenuti da adesione ad una Weck-Cel spugna chirurgica. La corteccia vitreo è poi tirato via dalla retina e asportato con le forbici Westcott (Figura 1). </li><li> Il campione è posto in una provetta per microcentrifuga e poi in azoto liquido. Tutti i campioni sono conservati a -80 ° C fino al momento utilizzato per la sperimentazione. </li></ol> 6. Rappresentante Risultati Campioni di tessuto possono essere elaborati da una varietà di metodi per esperimenti specifici. Nel nostro caso, i campioni sono stati sottoposti ad analisi delle proteine ​​mediante SDS-PAGE (Figura 3). <img src="/files/ftp_upload/2455/2455fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Vista in sezione trasversale dell'occhio umano raffigurante sottostrutture diverse del corpo vitreo. Il vitreo più anteriore è un sottile strato di collagene chiamato hyaloid anteriore. Il nucleo vitreo comprende l'intera regione centrale del corpo vitreo. Questa porzione del vitreo è più acquoso in contrasto con la base del vitreo, che è abbastanza viscoso per essere afferrato con pinze ed è saldamente attaccato al corpo ciliare e la retina sottostante. Che comprende il nucleo vitreo è un guscio molto sottile collagene chiamata corteccia vitreo. <img src="/files/ftp_upload/2455/2455fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Anatomia base del vitreo. La base del vitreo è un semi-trasparente sottostruttura del corpo vitreo situato lungo la serrata (frecce bianche), che è la linea di demarcazione che separa il corpo ciliare e la retina. Il margine anteriore della base del vitreo si estende su la pars plana (linea bianca) del corpo ciliare. Il bordo posteriore della base del vitreo si estende 2-3-mm posteriormente al serrata (trattino bianco). Per accise base del vitreo, pinze sono utilizzati per afferrare il tessuto e tirarlo via dal corpo ciliare e la retina sottostante. Una volta elevato, forbici Westcott sono usati per tagliare lungo la base. <img src="/files/ftp_upload/2455/2455fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Monodimensionale SDS-PAGE di elementi del corpo vitreo. Concentrazioni di proteine ​​totali del hyaloid anteriore, base del vitreo, vitnucleo reous, e la corteccia vitreo sono stati 11,24, 20.1, 16,61, 14,24 mg / ml, rispettivamente. Elettroforesi su gel è stata effettuata a 200 kV per 45 minuti, colorati con Flamingo (Bio-Rad), e visualizzati utilizzando un sistema VersaDoc Imaging (Bio-Rad). I profili per i diversi tessuti mostrano diversi gruppi simili, indicando sia conservata o cross-contaminazione delle proteine, così come unica band (asterisco), indicando proteine ​​differenzialmente localizzate.

<ol><li>Bishop, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+macromolecules+and+supramolecular+organisation+of+the+vitreous+gel%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel.</a> Prog Retin Eye Res. 19, 323-344 (2000).</li>
<li>Sebag, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biology+of+pharmacologic+vitreolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Trans+Am+Ophthalmol+Soc%22%5BJournal%5D)">Molecular biology of pharmacologic vitreolysis.</a> Trans Am Ophthalmol Soc. 103, 473-494 (2005).</li>
<li>Yoshimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+analysis+of+inflammatory+immune+mediators+in+vitreoretinal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comprehensive analysis of inflammatory immune mediators in vitreoretinal diseases.</a> PLoS One. 4, e8158-e8158 (2009).</li>
<li>Gao, B. B., Chen, X., Timothy, N., Aiello, L. P., Feener, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+vitreous+proteome+in+diabetes+without+diabetic+retinopathy+and+diabetes+with+proliferative+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of the vitreous proteome in diabetes without diabetic retinopathy and diabetes with proliferative diabetic retinopathy.</a> J Proteome Res. 7, 2516-2525 (2008).</li>
<li>Izuta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+SOD+and+VEGF+are+increased+in+vitreous+bodies+from+proliferative+diabetic+retinopathy+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Extracellular SOD and VEGF are increased in vitreous bodies from proliferative diabetic retinopathy patients.</a> Mol Vis. 15, 2663-2672 (2009).</li>
<li>Azimzadeh, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formalin-fixed+paraffin-embedded+%28FFPE%29+proteome+analysis+using+gel-free+and+gel-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) proteome analysis using gel-free and gel-based proteomics.</a> J Proteome Res. 9, 4710-4720 (2010).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il corpo vitreo è un gel semitrasparente cui composizione molecolare è poco conosciuta, soprattutto a livello delle sue sottostrutture: la base del vitreo, core, corteccia, e hyaloid anteriore. Il nucleo vitreo contiene collagene II, V, IX e XI, insieme con proteoglicani condroitin solfato, solfato di eparan proteoglicani e acido ialuronico. 1,2 biomarcatori proteine ​​nel nucleo vitreo sono stati associati a malattie come la retinopatia diabetica. 3-5 Come queste proteine ​​sono differenzialmente espressi in ciascuna delle sottostrutture, e in molti casi l&#39;identità specifica proteina, non sono noti. Questi dettagli può dare qualche idea per l&#39;origine delle proteine ​​associate a specifiche patologie vitreo-retinica e contribuire a future terapie target. Nonostante l&#39;ottimo intervallo post mortem per la dissezione dei tessuti non è stata determinata, la degradazione delle proteine ​​possono influenzare gli esperimenti a valle. Per esempio, l&#39;immunoistochimica è influenzato in 12 ore gli occhi post mortem ed alcune specifiche attività enzimatiche può essere ridotta entro poche ore (osservazione inedita). Tutti i tessuti in questo studio sono stati raccolti tra 2 e 8 ore di morte senza significativi cambiamenti nell&#39;espressione delle proteine ​​o idoneità per analsyis proteomica. Il metodo di congelamento azoto liquido di conservazione viene scelto più di fissaggio per evitare piccoli cambiamenti nella struttura delle proteine ​​causata da fissativo reticolazione, che è stato dimostrato in altri tessuti da LC-MS/MS. 6 studi di proteomica dipenderà dalla capacità di precisione sezionare i diversi compartimenti del vitreo, come dimostrato in questo esperimento video. Abbiamo convalidato la tecnica di dissezione con 1-dimensionale SDS-PAGE. Come i nostri risultati suggeriscono, ci sono proteine ​​differenzialmente espressi nelle diverse sottostrutture corpo vitreo. Identificare queste proteine ​​fornirà una comprensione più dettagliata di compartimentazione vitreo.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> 0,12 forcipe </td><td> Storz oftalmica </td><td> E1502 </td></tr><tr><td> 5-cc siringa </td><td> Becton Dickinson- </td><td> 309603 </td></tr><tr><td> Pinza diritta spogliatoio con dentellature </td><td> Storz oftalmica </td><td> E1400 </td></tr><tr><td> 23 gauge </td><td> Becton Dickinson- </td><td> 305145 </td></tr><tr><td> Colibri forcipe </td><td> Storz oftalmica </td><td> 2 / 132 </td></tr><tr><td> Castroviejo forbici angolata corneale </td><td> Storz oftalmica </td><td> E3223 </td></tr><tr><td> Vännäs Forbici capsulotomia curvo </td><td> Storz oftalmica </td><td> E3387 </td></tr><tr><td> Weck-Cel chirurgico lance </td><td> Medtronic </td><td> 0008680 </td></tr><tr><td> Forbici Tenotomia Westcott curvo </td><td> Storz oftalmica </td><td> E3320 </td></tr></tbody></table>

dissezione di human elements corpo vitreo per l&#39;analisi proteomica

Dissection of Human Vitreous Body Elements for Proteomic Analysis

Il vitreo è una otticamente chiaro, matrice di collagene extracellulare che riempie l&#39;interno dell&#39;occhio e sovrappone la retina. 1,2 interazioni anomale tra sottostrutture vitreo e la retina alla base di diverse patologie vitreo-retinica, tra cui rottura retinica e distacco, pucker maculare, foro maculare, età degenerazione maculare, la trazione vitreomacular, proliferazione vitreoretinica, retinopatia diabetica proliferativa, e vitreoretinopathies ereditato. 1,2 La composizione molecolare delle sottostrutture vitreo non è noto. Poiché il corpo vitreo è trasparente con limitato accesso chirurgico, è stato difficile studiare le sue sottostrutture a livello molecolare. Abbiamo sviluppato un metodo per separare e conservare questi tessuti per l&#39;analisi proteomica e biochimica. La tecnica di dissezione in questo video sperimentale mostra come isolare base del vitreo, hyaloid anteriore, centrale vitreo, e la corteccia vitreo da occhi umani post-mortem. Monodimensionale SDS-PAGE analisi di ogni componente vitreo ha dimostrato che la nostra tecnica dissezione portato a quattro profili proteici uniche corrispondenti a ciascuna sottostruttura del corpo vitreo umano. Identificazione di proteine ​​differenzialmente compartimenti rivelerà molecole candidate sottostante varie malattie vitreo-retinica.

Questo video mostra una tecnica efficace per differenziare e sezionare le varie semitrasparente strutture del corpo vitreo in post mortem occhi.

Dissezione di Human Elements corpo vitreo per l&#39;analisi proteomica

Il vitreo è una matrice extracellulare collagenica, otticamente trasparente, che riempie l'interno dell'occhio e sovrasta la retina. 1,2 Interazioni anormali...

Il vitreo è una matrice extracellulare otticamente trasparente che riempie l'interno dell'occhio. Può essere suddiviso in diverse sottotramature, tra cui l'ialoide anteriore dietro al cristallino, la base vitreale alla retina anteriore, la corteccia vitreale che forma un involucro elastico e il nucleo vitreale al centro. Per dissezionare il vitreo, dobbiamo prima rimuovere il segmento anteriore.Si utilizza una lama estremamente affilata per incisionare la cornea al limbo. Successivamente si usano forbici corneo-sclerali per tagliare la cornea appena anteriormente al limbo. L'iride viene dissezionata con forbici curve tirandola dalla sua superficie.Applicando una pressione delicata sul globo oculare è possibile espellere il nucleo. Per rimuovere il nucleo vitreo, utilizzare un ago da 23 gauge su una siringa da 5 cc ed aspirare il vitreo prevalentemente liquido. L'ialoide anteriore diventa visibile come una sottile struttura membranosa trasparente che può essere afferrata con una pinzetta.È una struttura elastica situata appena dietro la lente. Il cerchio interno è il legamento di Wit. Le forbici di Van vengono utilizzate per tagliare l'ialoide mentre la pinza applica trazione.Il tessuto lat può essere trasferito in un tubo afu e la manovra viene ripetuta fino a quando tutto il tessuto è stato dissezionato. Per accedere alle restanti sottotramature vitreali, è necessario aprire l'occhio utilizzando forbici curve di Westcott. Ognuno dei lembi viene deviato con pinzette in una piastra di Petri.Questa immagine mostra l'anatomia della base vitrea, un tessuto sottile e trasparente che si estende lungo la ora serrata. La ora serrata è la linea di demarcazione tra il corpo ciliare in posizione anteriore e la retina in posizione posteriore. A differenza di altre parti del vitreo, la base vitrea aderisce saldamente al corpo ciliare e alla retina sottostanti, pertanto una trazione con pinze solleva effettivamente il tessuto.Per isolare la base vitrea, rimuoviamo innanzitutto la pars plana utilizzando pinzette e forbici di Wescott. La pars plana è questa piccola area con delle creste. Successivamente, per isolare la base vitrea, effettuare un taglio da due a tre millimetri posteriormente all'ora con le forbici di Wescott, stabilizzando l'occhio con le pinzette, quindi afferrare e applicare trazione sulla base vitrea utilizzando le pinzette ed effettuare tagli consecutivi con le forbici di Wescott.Si osserva un aspetto simile a una collana di perle quando la base vitrea viene escissa, e si può notare come questa matrice extracellulare possa compartimentalizzare le proteine. Diverse tecniche possono essere utilizzate per dissezionare l'involucro del vitreo. Il contatto con una spugna cellulare WEX solleverà la corteccia.Un margine della corteccia vitrea può essere individuato tra i lembi come mostrato qui. Nuovamente, utilizzare la pinza per creare trazione e recuperare le forbici di VanNess per tagliare in successione la corteccia vitrea. La corteccia può anche essere sollevata dal disco ottico e, in questo caso, vengono impiegate forbici westcot più grandi per dissezionare la corteccia mentre viene delicatamente staccata dalla superficie della retina.I campioni possono quindi essere posizionati in un micro e conservati per successive analisi proteomiche.

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Eviscerazione delle Vitreous Mouse e Retina per analisi proteomica

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Vibratome sezionamento mouse Retina preparare Culture fotorecettori

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