Produzione di pseudovirus tramite trasfezione di plasmidi in cellule umane

Iniziare con una fiala da coltura contenente cellule renali embrionali umane in un mezzo ricco di nutrienti.

Sostituire il mezzo con del mezzo fresco contenente cloroquina per migliorare il trasferimento del plasmide nelle cellule.

Prelevare una miscela di plasmidi che codificano le proteine di superficie dell'influenza, le proteine core del lentivirus e il genoma del lentivirus, insieme al fosfato di calcio. Incubare per formare complessi di DNA con fosfato di calcio.

Aggiungere la miscela alle cellule e mescolare delicatamente. Incubare per consentire l'ingresso del complesso nelle cellule mediante endocitosi. Il cloroichina favorisce l'uscita plasmidica dagli endosomi.

All'interno della cellula, il DNA plasmidico induce l'espressione di entrambi i componenti influenzali e lentivirali.

Sostituire il mezzo per rimuovere i complessi in eccesso.

Incubare per permettere l'assemblaggio dei componenti virali e il rilascio come pseudovirus, che vengono secreti nel mezzo di coltura.

Raccogliere il mezzo contenente i pseudovirus e centrifugare per formare un pellet di detriti cellulari.

Raccogliere il surnatante contenente il pseudovirus e conservarlo a basse temperature per saggi successivi.

Per iniziare, preparare una sospensione monocellulare di cellule HEK 293FT in un mezzo DMEM completo. Aggiungere dieci millilitri della sospensione monocellulare a un’aliquota T75, seguita da incubazione a trentasette gradi Celsius.

Due ore prima della trasfezione, sostituire il vecchio mezzo con dieci millilitri di mezzo completo fresco contenente cloroquina. Mescolare i reagenti e il DNA plasmidico come descritto nel manoscritto. Successivamente, trasferire questa miscela nel mezzo sopra le cellule e agitare delicatamente.

Dopo l'incubazione, sostituire il mezzo con quindici millilitri di mezzo DMEM completo fresco. Dopo sessantacinque ore, raccogliere il sopranatante mediante centrifugazione. Raccogliere il sopranatante e aliquotarlo.