JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Microbiologia
0 visualizzazioni • 2:54 min. • August 31st, 2026
Prelevare un occhio da un modello murino con barriera retinica compromessa, preiniettato con virus adeno-associato portatore del gene della proteina fluorescente verde.
La barriera retinica compromessa permette all'AAV di penetrare nelle cellule fotoricettori, dove il genoma virale viene espresso per produrre GFP, rendendo le cellule fluorescenti.
Dissezionare l'occhio per rimuovere la cornea e il cristallino, lasciando intatto il cupola oculare.
Immergere l'occhio in una soluzione fissativa per preservare la struttura della retina.
Trasferire l'occhio in modo sequenziale attraverso concentrazioni crescenti di soluzioni crioprotettive. Successivamente, incubare nella concentrazione finale per prevenire la formazione di cristalli di ghiaccio.
Incorpora l'occhio in un mezzo criogenico e congela.
Utilizzando un criostato, sezionare l'occhio in fette sottili.
Montare il campione su un vetrino. Aggiungere un buffer contenente detergenti per permeabilizzare il tessuto, consentendo l'accesso dell'anticorpo durante la successiva immunomarcatura.
Risciacquare la sezione. Trattarla con una soluzione bloccante per prevenire interazioni anticorpali aspecifiche durante l'immunomarcatura.
La crio-sezione retinica è pronta per ulteriori procedure di immunomarcatura e per l'analisi mediante imaging a fluorescenza. Le cellule fluorescenti positive per GFP rivelano una transduzione virale riuscita, indicativa di permeabilità retinica.
Dopo aver prelevato gli occhi da un animale iniettato e sacrificato, dissezionare gli occhi per rimuovere lente e cornea. Successivamente, fissare per immersione l'occhio dissezionato in paraformaldeide al 4% per un'ora. Dopo un'ora, crioproteggere gli occhi in soluzione di saccarosio al 10% per un'altra ora a temperatura ambiente. Quindi immergere gli occhi in saccarosio al 20% per un terzo di ora a temperatura ambiente.
Infine, lasciare gli occhi in soluzione di saccarosio al 30% durante la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, incorporare e congelare le coppette oculari in una resina di inclusione come il cryo matrix. Quindi, utilizzando il criostato, preparare sezioni di 10 micron e montarle su vetrini predisposti per tessuti congelati.
Ora permeabilizzare i campioni sui vetrini con un detergente per cinque minuti. Eseguire quindi due brevi lavaggi in PBS. Successivamente, bloccare gli occhi per un'ora a temperatura ambiente.