Preparazione di criosezioni di retina di topo per valutare la permeabilità retinica ai virus adeno-associati
JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Microbiologia
0 visualizzazioni • 2:54 min. • August 31st, 2026
Prelevare un occhio da un modello murino con barriera retinica compromessa, preiniettato con virus adeno-associato portatore del gene della proteina fluorescente verde.
La barriera retinica compromessa permette all'AAV di penetrare nelle cellule fotoricettori, dove il genoma virale viene espresso per produrre GFP, rendendo le cellule fluorescenti.
Dissezionare l'occhio per rimuovere la cornea e il cristallino, lasciando intatto il cupola oculare.
Immergere l'occhio in una soluzione fissativa per preservare la struttura della retina.
Trasferire l'occhio in modo sequenziale attraverso concentrazioni crescenti di soluzioni crioprotettive. Successivamente, incubare nella concentrazione finale per prevenire la formazione di cristalli di ghiaccio.
Incorpora l'occhio in un mezzo criogenico e congela.
Utilizzando un criostato, sezionare l'occhio in fette sottili.
Montare il campione su un vetrino. Aggiungere un buffer contenente detergenti per permeabilizzare il tessuto, consentendo l'accesso dell'anticorpo durante la successiva immunomarcatura.
Risciacquare la sezione. Trattarla con una soluzione bloccante per prevenire interazioni anticorpali aspecifiche durante l'immunomarcatura.
La crio-sezione
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