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Microbiologia
0 visualizzazioni • 2:24 min • August 31st, 2026
Iniziare con l'occhio di un topo transgenico precedentemente iniettato con un virus adeno-associato (AAV) contenente il gene di interesse che codifica per una proteina fluorescente.
Il topo non possiede un gene essenziale per il mantenimento dell'integrità della membrana limitante interna (ILM), una barriera che separa la retina dalla cavità vitrea.
La perdita di questo gene imita la degenerazione retinica, consentendo al virus di penetrare più in profondità nei livelli cellulari della retina.
Le cellule retiniche infette esprimono il gene di interesse, producendo proteine fluorescenti, consentendo loro di emettere fluorescenza.
Ora, dissezionare l'occhio e rimuovere la cornea e il cristallino.
Staccare con attenzione la retina dall'epitelio pigmentato retinico (RPE) e dalla sclera, lo strato esterno dell'occhio.
Immergere il tessuto nel fissativo.
Lavare con tampone fosfato per rimuovere il fissativo residuo.
Quando osservato al microscopio confocale, la fluorescenza nelle cellule retiniche indica un efficace passaggio virale attraverso la membrana limitante interna compromessa.
Per i preparati piatti della retina, facilitare la dissezione fissando gli occhi enucleati in paraformaldeide al 4% per 15-30 minuti. Questa fissazione e quella successiva alla dissezione devono essere eseguite correttamente poiché sono fondamentali per preservare la fluorescenza di GFP. Entro 15-30 minuti dal periodo di fissazione, dissezionare gli occhi, rimuovendo la cornea e il cristallino.
Separare la retina dall'epitelio pigmentato retinico e dalla sclera praticando un taglio intorno all'ora serrata e al nervo ottico. Dopo la dissezione, immergere le retine in paraformaldeide al 4% per altri 30 minuti per fissare il tessuto e la proteina fluorescente nelle cellule retiniche transdotte. Dopo la fissazione, lavare il campione per cinque minuti in PBS sterile a pH 7,4.