JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Microbiologia
0 visualizzazioni • 4:12 min. • August 31st, 2026
Iniziare con epatociti coltivati su una piastra rivestita di collagene.
Introdurre un complesso di reagente per la trasfezione con due plasmidi: uno che contiene un genoma modificato del virus dell'epatite B o HBV, e l'altro che codifica per le proteine strutturali virali.
Incubare per consentire l'ingresso del plasmide. All'interno della cellula, i geni virali vengono espressi per produrre proteine strutturali e un genoma HBV modificato, che si assemblano per formare particelle di HBV ricombinante.
Sostituire il mezzo e incubare per favorire la produzione e il rilascio delle particelle virali.
Raccogliere il mezzo e centrifugare per ottenere un pellet dei detriti.
Raccogliere il sopernatante e filtrarlo per rimuovere i detriti rimanenti.
Successivamente, aggiungere polietilene glicole e cloruro di sodio per precipitare le particelle virali.
Centrifugare per ottenere il pellet del contenuto. Sciogliere il pellet in tampone e centrifugare per rimuovere i detriti. Successivamente, stratificare il campione su un cuscino di saccarosio.
Eseguire l'ultracentrifugazione per sedimentare le particelle virali attraverso l'ammortizzatore.
Rimuovere il soprannatante e risospendere il pellet nel mezzo.
Filtrare la sospensione e conservare l'HBV ricombinante purificato a bassa temperatura per analisi successive.
Dopo aver preparato il mezzo di coltura cellulare, il giorno precedente la trasfezione, piastrare 4 x 106 cellule HepG2 nel mezzo su una piastra da 10 cm rivestita con collagene. Incubare le cellule a 37 °C in un'atmosfera umidificata con 5% di CO2.2 incubatrice. Trasfettare le cellule con 5 mcg di pUC1.2HBV utilizzando un agente di trasfezione secondo le istruzioni del produttoreΔεe 5 mcg di pUC1.2HBV/NL.
Il giorno successivo, rimuovere il mezzo di coltura e aggiungere 10 mL di mezzo di coltura fresco. Quindi, una settimana dopo la trasfezione, trasferire il mezzo di coltura contenente l'HBV ricombinante in un tubo da 50 mL.
Quindi raccogliere e centrifugare il mezzo di coltura a 2.300 x g per cinque minuti per rimuovere i detriti cellulari contenenti l'HBV ricombinante. Far passare il sopranatante attraverso un filtro membrana da 0,45 µm. Aggiungere quindi un volume uguale di PEG al 25%, NaCl 1,5 M, al filtrato e mescolare delicatamente.
Incubare il campione tutta la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno seguente, centrifugare la soluzione a 2.300 × g e quattro gradi Celsius per 20 minuti. Eliminare il soprannatante e sciogliere il pellet in 0,5 mL di tampone TNE. Successivamente, caricare 0,5 mL della soluzione di TNE contenente HBV ricombinante su 0,8 mL di saccarosio al 20% in TNE.
Centrifugare i due a 100.000 × g e 15 gradi Celsius per tre ore. Eliminare il più possibile il soprannatante e utilizzare 1 mL di DMEM senza siero per ogni 40 mL di mezzo di coltura iniziale per risospendere il pellet. Incubare la sospensione a quattro gradi Celsius durante la notte. La mattina seguente, filtrare la sospensione attraverso un filtro da 0,45 µm. Quindi preparare aliquote da 0,5 mL e conservare le provette a meno 80 gradi Celsius.