Visualizzazione di capsidi virali trattati termicamente mediante microscopia elettronica a trasmissione

Prendere i tubi contenenti i capside virali, che sono particelle simili a virus prive di materiale genetico.

Riscaldare i tubi a una temperatura costante per durate variabili.

Una durata di riscaldamento più breve sottopone lievemente a stress le proteine del capside, mentre un riscaldamento prolungato altera il capside e provoca aggregazione.

Raffreddare rapidamente i tubi per prevenire ulteriori cambiamenti strutturali.

Trasferire il liquido su un film di paraffina.

Posizionare una griglia per microscopia elettronica a trasmissione (TEM) sulla goccia. I capside si attaccano alla superficie della griglia.

Asciugare la griglia con un foglio di carta da filtro per rimuovere il liquido in eccesso.

Lavare con un tampone per rimuovere i capside debolmente associati, quindi asciugare nuovamente la griglia.

Immergere in acetato di uranile, un colorante a base di metalli pesanti che si lega alla superficie del capside, rendendoli più scuri in microscopia elettronica a trasmissione (TEM).

Asciugare la griglia e posizionarla su una piastra. Conservare la piastra in un essiccatore per rimuovere l'umidità.

Acquisire l'immagine della griglia mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM) per visualizzare i danni al capside indotti dal calore.

Eseguire il trattamento termico come in precedenza, sostituendo il PBS al 10 millimolare HEPES, pH 7,4, e non diluire ulteriormente i capside dopo il trattamento. Successivamente, pipettare l'intera goccia di 15 microlitri di soluzione di capside trattata sul film di paraffina. Afferrare il bordo della griglia con pinzette, permettendo loro di chiudersi sul bordo per trattenere la griglia, e posizionare la griglia con il lato al carbonio rivolto verso il basso sulla sommità della goccia di soluzione trattata.

Lasciare il griglia in incubazione per 10 minuti per consentire l'attacco del capside alla griglia. A seconda della purezza della preparazione del capside, aggiungere lavaggi con soluzione HEPES sotto forma di gocce da 10 a 15 microlitri posizionate in fila dopo la goccia di capside trattato. Dopo 10 minuti, prelevare la griglia con la goccia.

Posizionare la griglia quasi perpendicolarmente a un pezzo di carta da filtro per assorbire la goccia. Successivamente, utilizzare la griglia per raccogliere la goccia di 10-15 µL di tampone HEPES e mantenerla per 30 secondi. Dopo 30 secondi di lavaggio, asportare il liquido con un altro pezzo di carta da filtro.

Successivamente, posizionare una goccia di 15 microlitri di soluzione al due percento di acetato di uranile su un'area vuota del film di paraffina. Raccogliere la goccia di acetato di uranile con la griglia e mantenerla per 45 secondi. Quindi, asportare l'acetato di uranile assicurandosi di rimuovere la maggior parte della soluzione.

Posizionare la griglia con il lato di carbonio rivolto verso l'alto su un pezzo di carta da filtro, avendo cura che la griglia non si attacchi all'umidità sulle pinzette. Successivamente, posizionare la carta da filtro con la griglia al suo interno in una capsula di Petri di vetro aperta. Dopo aver ripetuto questo processo per tutti i trattamenti, collocare le mezze capsule di Petri con le griglie in un essiccatore per tutta la notte per farle asciugare prima dell'osservazione al MET.