JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Microbiologia
0 visualizzazioni • 2:30 min. • August 31st, 2026
Iniziare con organoidi intestinali di topo che sono stati parzialmente dissociati per facilitare la trasduzione lentivirale.
Prendere i vettori lentivirali in un mezzo di trasduzione.
Il lentivirus trasporta un gene di interesse per l'integrazione stabile nel genoma dell'ospite.
Aggiungere il lentivirus nel pozzetto.
Incubare la miscela per consentire l'ingresso virale.
L'RNA virale viene trascritto al contrario in DNA e si integra nel genoma dell'ospite.
Aggiungere il mezzo per organoidi e trasferire la miscela in un tubo.
Centrifugare per rimuovere eventuali virus non legati.
Mescolare il pellet in una matrice della membrana basale.
Posizionare gli organoidi in una pozzetta e lasciarli solidificare.
La matrice forma una rete che intrappola gli organoidi e fornisce supporto strutturale.
Aggiungere mezzo per organoidi integrato con promotori della crescita per favorire la proliferazione degli organoidi.
Questo porta alla formazione di organoidi in gemmazione contenenti il gene transdotto, che possono essere utilizzati per ulteriori analisi funzionali.
Trasferire gli organoidi in questa ultima piccola quantità di mezzo in una pozzetta di una piastra a 48 pozzette.
Aggiungere il lentivirus ad alto titolo precedentemente preparato nel mezzo di trasduzione agli organoidi e risospendere. Incubare la miscela organoide-virus per un'ora a 37 gradi Celsius in un incubatore di coltura per consentire la trasduzione. Dopo un'ora, aggiungere un millilitro di mezzo di coltura per organoidi alla miscela organoide-virus, risospendere e trasferire la miscela in una provetta da microcentrifuga; centrifugare a 850 x g per cinque minuti.
Per formare il pellet degli organoidi, rimuovere il sopranatante e risospendere il pellet in 20 microlitri di Matrigel freddo. Posizionare la goccia al centro di un pozzetto. In una piastra a 48 pozzetti, incubare a 37 gradi Celsius per 15 minuti affinché la goccia si solidifichi. Dopo 15 minuti, aggiungere con attenzione 250 microlitri di mezzo di coltura per organoidi integrato con nicotinamide e inibitori della chinasi.