JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Microbiologia
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Prelevare colture di cellule di cancro al seno.
Co-infettare con due tipi di adenovirus. Uno dei due trasporta un gene della proteina fluorescente verde o GFP sotto un promotore costitutivamente attivo.
L'altro contiene un gene reporter che codifica per la proteina fluorescente rossa o RFP, sotto un promotore responsivo allo SMAD.
Aggiungere il fattore di crescita trasformante beta (TGF-beta) alla coltura di prova e incubare.
I virusi si legano al recettore per entrare nella cellula ospite, consegnano i geni nel nucleo e permettono l'espressione della GFP.
Nelle cellule in prova, il TGF-beta si lega al suo recettore e attiva la via di segnalazione SMAD mediante la fosforilazione delle proteine SMAD2 e SMAD3.
Queste proteine formano un complesso con SMAD4.
Questo complesso si lega al promotore del gene reporter, consentendo l'espressione di RFP in aggiunta a GFP.
Nel controllo, il percorso SMAD rimane inattivo, consentendo alle cellule di esprimere solo GFP.
Acquisire immagini fluorescenti di cellule vive.
La presenza di entrambi i segnali conferma l'attivazione del percorso SMAD mediante transduzione con doppio adenovirus.
Nel giorno dell'infezione con adenovirus, seminare le pozzette di una
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