JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologia
0 visualizzazioni • 2:40 min • August 31st, 2026
Prelevare colture di cellule di cancro al seno.
Co-infettare con due tipi di adenovirus. Uno dei due trasporta un gene della proteina fluorescente verde o GFP sotto un promotore costitutivamente attivo.
L'altro contiene un gene reporter che codifica per la proteina fluorescente rossa o RFP, sotto un promotore responsivo allo SMAD.
Aggiungere il fattore di crescita trasformante beta (TGF-beta) alla coltura di prova e incubare.
I virusi si legano al recettore per entrare nella cellula ospite, consegnano i geni nel nucleo e permettono l'espressione della GFP.
Nelle cellule in prova, il TGF-beta si lega al suo recettore e attiva la via di segnalazione SMAD mediante la fosforilazione delle proteine SMAD2 e SMAD3.
Queste proteine formano un complesso con SMAD4.
Questo complesso si lega al promotore del gene reporter, consentendo l'espressione di RFP in aggiunta a GFP.
Nel controllo, il percorso SMAD rimane inattivo, consentendo alle cellule di esprimere solo GFP.
Acquisire immagini fluorescenti di cellule vive.
La presenza di entrambi i segnali conferma l'attivazione del percorso SMAD mediante transduzione con doppio adenovirus.
Nel giorno dell'infezione con adenovirus, seminare le pozzette di una piastra a 12 pozzette con circa 1,25 volte 10 alla quinta cellule MDA-MB-231 in 500 microlitri di mezzo per ottenere una confluenza del 35%. Infettare le cellule in tutte le pozzette con 75 microlitri di adenovirus-CMV-GFP e 7,5 microlitri di adenovirus CAGA12-Td-Tomato per ottenere un MOI di 2.500, valore che consente di raggiungere una positività all'infezione del 100%. Successivamente, aggiungere il TGF-beta alla pozzetta di trattamento immediatamente dopo l'infezione con adenovirus.
Incubare a 37 gradi Celsius con il 10% di anidride carbonica per 24 ore. Il giorno successivo, acquisire immagini di cellule vive mediante microscopio a fluorescenza in contrasto di fase.