Imaging a fluorescenza multiplex di acidi nucleici virali e proteine in linfociti umani infetti

Si parte da linfociti umani infettati con HIV-1 su un vetrino montato su un portaoggetti.

Queste cellule sono state ibridate con sonde che etichettano fluorescentemente l'RNA virale e il DNA provirale.

Incubare le cellule in una soluzione di blocco per prevenire il legame non specifico degli anticorpi.

Introdurre gli anticorpi primari diretti contro la proteina dell'capside dell'HIV-1.

Incubare per permettere agli anticorpi primari di legarsi alla proteina della capside.

Lavare le cellule con tampone per rimuovere gli anticorpi non legati.

Aggiungere gli anticorpi secondari marcati con fluorocromo che si legano agli anticorpi primari.

Lavare gli anticorpi non legati.

Aggiungere un colorante specifico per il DNA per colorare i nuclei delle cellule, quindi lavare per rimuovere l'eccesso di colorante.

Utilizzare l'immagine di fluorescenza multiplex per rilevare simultaneamente DNA virale, RNA, proteine e nuclei dell'ospite in colori distinti.

Questa visualizzazione a singola cellula consente lo studio delle diverse fasi del ciclo vitale virale attraverso la visualizzazione simultanea di DNA, RNA e proteine virali nelle cellule infette.

Per l'immunomarcatura delle proteine di interesse, dopo l'ul