JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Microbiologia
0 visualizzazioni • 2:36 min. • August 31st, 2026
Si parte da linfociti umani infettati con HIV-1 su un vetrino montato su un portaoggetti.
Queste cellule sono state ibridate con sonde che etichettano fluorescentemente l'RNA virale e il DNA provirale.
Incubare le cellule in una soluzione di blocco per prevenire il legame non specifico degli anticorpi.
Introdurre gli anticorpi primari diretti contro la proteina dell'capside dell'HIV-1.
Incubare per permettere agli anticorpi primari di legarsi alla proteina della capside.
Lavare le cellule con tampone per rimuovere gli anticorpi non legati.
Aggiungere gli anticorpi secondari marcati con fluorocromo che si legano agli anticorpi primari.
Lavare gli anticorpi non legati.
Aggiungere un colorante specifico per il DNA per colorare i nuclei delle cellule, quindi lavare per rimuovere l'eccesso di colorante.
Utilizzare l'immagine di fluorescenza multiplex per rilevare simultaneamente DNA virale, RNA, proteine e nuclei dell'ospite in colori distinti.
Questa visualizzazione a singola cellula consente lo studio delle diverse fasi del ciclo vitale virale attraverso la visualizzazione simultanea di DNA, RNA e proteine virali nelle cellule infette.
Per l'immunomarcatura delle proteine di interesse, dopo l'ultimo lavaggio, trattare ogni coverslip con 200 microlitri di soluzione bloccante per un'incubazione di un'ora a temperatura ambiente.
Al termine dell'incubazione, versare via il buffer di blocco e aggiungere 200 microlitri dell'anticorpo primario di interesse diluito in PBS più Tween 20, integrato con il 1% di albumina sierica bovina. Dopo un'incubazione di un'ora a temperatura ambiente, lavare i vetrini con due lavaggi di 10 minuti ciascuno in PBS fresco più Tween 20, agitando ad ogni lavaggio, prima di etichettare i campioni con un anticorpo secondario appropriato per un'ora a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, lavare i vetrini due volte con PBS fresco più Tween 20 per 10 minuti, agitando ad ogni lavaggio.
Dopo il secondo lavaggio, controcolorare i nuclei con un colorante nucleare appropriato per un minuto a temperatura ambiente, seguito da due lavaggi in PBS per 10 minuti a temperatura ambiente con agitazione.