JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Microbiologia
0 visualizzazioni • 3:36 min. • August 31st, 2026
Iniziare con una sospensione contenente precipitati di intasomi del virus della foamy prototipo o PFV, integrasi monomerici, oligomeri di DNA e aggregati proteici.
Gli intasomi del PFV sono tetrameri di integrasi virali complessati con oligomeri sintetici che mimano il DNA genomico virale.
Aggiungere una soluzione salina alla sospensione e incubare sul ghiaccio. Il sale riduce l'interazione elettrostatica tra gli intasomi, consentendo ai precipitati di solubilizzarsi.
Pipettare delicatamente a intervalli regolari per favorire la solubilizzazione dell'intasoma.
Centrifugare per formare il pellet del precipitato residuo e raccogliere il sopranatante contenente gli intasomi solubili.
Prendere una colonna di cromatografia a esclusione dimensionale preriscaldata, riempita con perline di agarosio reticolato, e caricare il sopranatante sulla colonna.
A causa delle loro grandi dimensioni, gli aggregati proteici e gli intasomi bypassano i pori delle perle e vengono eluiti precocemente.
Gli integrasi monomerici più piccoli e gli oligomeri entrano nei pori delle perle e vengono eluiti in un secondo momento.
Raccogliere le frazioni eluite precocemente contenenti intasomi per ulteriori analisi a valle.
Preparare due punte di pipetta a foro largo rimuovendo da due a quattro millimetri dall'estremità di una punta da 200 microlitri, utilizzando una nuova lametta o una lama di bisturi su una superficie pulita. Rimuovere il tubo da dialisi dal tampone di dialisi. Per evitare la diluizione del campione di intasoma con il tampone di dialisi che potrebbe rimanere all'estremità del tubo vicino alla clip, utilizzare una micropipetta con una punta piccola per rimuovere qualsiasi eccesso di tampone di dialisi.
Rimuovere la clip da questo estremo del tubo di dialisi. Durante il recupero dell'assemblaggio, è importante raccogliere la maggior quantità possibile di soluzione e precipitato. Utilizzare la pipetta a foro largo per trasferire il campione, inclusa la frazione precipitata, all'interno del tubo di dialisi in un tubo da 1,5 millilitro posto sul ghiaccio.
Notare il volume totale del materiale recuperato. Il volume totale è tipicamente di circa 140 microlitri. Il campione con il precipitato è a 200 millimolare di cloruro di sodio.
Aumentare il sale a una concentrazione finale di 320 millimolare di cloruro di sodio aggiungendo il volume appropriato di una soluzione stock di cloruro di sodio cinque molare. Trasferire il secchio con ghiaccio contenente il campione in una stanza fredda a quattro gradi Celsius. Utilizzare la punta pipetta a grande apertura per risospendere e solubilizzare il precipitato mediante pipettaggio.
Ripetere ogni 20 minuti per almeno un'ora. La maggior parte del precipitato dovrebbe passare in soluzione. Per purificare l'intasoma, equilibrare una colonna di cromatografia a esclusione molecolare (SEC) in agarosio reticolato con il buffer di eluizione SEC a un flusso di 0,4 millilitri al minuto.
Centrifugare il campione di intasoma in una microcentrifuga a 14.000 × g per 10 minuti a 4 °C per formare un pellet del precipitato residuo. Dopo aver rimosso con attenzione il sopranatante, caricarlo su un loop di iniezione da 200 µL. Applicare il campione sulla colonna di cromatografia ad esclusione molecolare (SEC).
Eluire con 25 millilitri di tampone di eluizione SEC e raccogliere 95 frazioni da 270 microlitri. Osservare che il cromatogramma SEC mostra tre picchi A280 e A260.