Ottenimento dell'RNA virale per l'analisi mediante reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (qPCR)

Iniziare con una soluzione standard di RNA virale sintetizzato e diluito in serie nel mezzo di coltura.

Queste diluizioni fungono da standard di riferimento per quantificare l'RNA virale nei campioni.

Ora, prelevare il soprannatante contenente il virus dalla coltura cellulare infetta.

Questo mezzo di coltura contiene un inibitore che si lega agli enzimi degradanti l'RNA e ne previene la degradazione dell'RNA virale.

Aggiungere il buffer di lavorazione contenente l'enzima proteinasi K.

Centrifugare brevemente la soluzione per un mescolamento uniforme.

Posizionare la piastra PCR contenente i campioni nel termociclatore.

Prima, incubare a una temperatura moderata per attivare la proteinasi K.

Questo enzima digerisce le proteine virali che incapsulano il genoma, liberando l'RNA virale nella soluzione.

Successivamente, incubare a una temperatura più elevata per inattivare l'enzima e denaturare l'RNA.

Infine, conservare i campioni processati in condizioni di freddo fino all'analisi di PCR quantitativa in tempo reale.

Per prima cosa, mescolare 199 microlitri di tampone di lavorazione con un microlitro di proteinasi K priva di nucleasi. Utilizzando mezzo di coltura cellulare, diluire in serie l'RNA della regione UTR 3' del virus Dengue da uno a dieci per ottenere standard di RNA a concentrazioni comprese tra 5.000.000 e 5.000 copie per microlitro, ripetendo le operazioni di pipettaggio e vortex. Trasferire 5 microlitri del surnatante di coltura di cellule infettate dal virus Dengue e dello standard di RNA della regione UTR 3' del virus Dengue rispettivamente nei pozzetti degli strip PCR A2 o in quelli di una piastra PCR a 96 pozzetti.

Mescolare cinque microlitri della soluzione contenente il buffer di lavorazione e la proteinasi K. Centrifugare brevemente a 200 ×g per cinque secondi. Incubare i campioni in un termociclatore a 25 °C per dieci minuti e poi a 75 °C per cinque minuti.