JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologia
0 visualizzazioni • 2:52 min • August 31st, 2026
Si inizia con una coltura di cellule di cancro al fegato umano trasfettate con RNA del virus dell'epatite E (HEV) per produrre particelle virali.
Alcuni HEV acquisiscono una membrana endosomiale di origine ospite ed escono dalla cellula, mentre altri rimangono all'interno della cellula come HEV non rivestiti.
Per raccogliere gli HEV extracellulari, raccogliere e filtrare il surnatante di coltura per rimuovere i detriti cellulari.
Conservare a una temperatura ultra-bassa per preservare l'infettività.
Per raccogliere gli HEV intracellulari, lavare le cellule con un buffer.
Aggiungere tripsina-EDTA per staccare le cellule, quindi aggiungere un mezzo per arrestare l'attività enzimatica.
Trasferire la sospensione in un tubo e centrifugare.
Scartare il soprannatante contenente la tripsina residua. Ri-sospendere il pellet e trasferirlo in una provetta.
Congelare le cellule in azoto liquido e scongelarle sul ghiaccio.
Ripetere i cicli di congelamento-scongelamento per lisare le cellule, rilasciando i virus.
Centrifugare, raccogliere il soprannatante contenente i virus e conservare a una temperatura ultra-bassa.
A giorno sei, filtrare il sopranatante attraverso una membrana da 0,45 micrometri per rimuovere eventuali detriti cellulari e conservare il virus dell'epatite E derivato da colture cellulari extracellulari raccolto a quattro gradi Celsius. Per la raccolta delle particelle virali intracellulari del virus dell'epatite E derivato da colture cellulari, lavare le cellule con PBS e staccare le cellule con 1,5 millilitri di tripsina-EDTA allo 0,05% a 37 gradi Celsius. Una volta che le cellule si sono staccate, arrestare la reazione con 8,5 millilitri di DMEM e trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 50 millilitri per la centrifugazione.
Aggiungere 1,6 millilitri di mezzo DMEM completo per elettroporazione in provette da reazione individuali da due millilitri e utilizzare 800 microlitri del mezzo per risospendere le cellule, trasferendole così nelle provette. Congelare le cellule in azoto liquido e successivamente scongelarle sul ghiaccio per tre volte prima di centrifugare ad alta velocità i lisati ottenuti per 10 minuti a 10.000 ×g. Trasferire quindi i soprannatanti in nuove provette senza disturbare i pellet di detriti cellulari per il successivo stoccaggio a meno 80 gradi Celsius.