Purificazione del virus dal liquido allantoideo di uova di pollo embrionate

Iniziare con un serbatoio contenente liquido allantocoide raccolto da uova di pollo infette dal virus.

Questo fluido contiene particelle virali insieme a contaminanti di origine ospite.

Filtrare il liquido attraverso un filtro a profondità per trattenere i contaminanti di grandi dimensioni, permettendo nel contempo il passaggio dei contaminanti più piccoli e dei virus.

Quindi, caricare il liquido filtrato in un sistema di filtrazione, dove scorre tangenzialmente lungo una superficie di membrana.

I contaminanti più piccoli passano attraverso la membrana, mentre il virus viene trattenuto e concentrato.

Caricare il virus concentrato su un gradiente di densità e centrifugarlo. Il virus forma una banda distinta in cui la sua densità corrisponde a quella del gradiente.

Raccogliere la banda ricca di virus in una cassetta per dialisi e immergerla in un tampone. I componenti del gradiente diffondono all'esterno, mentre l'acqua del tampone diffonde all'interno attraverso la membrana semipermeabile.

Successivamente, posizionare la cassetta in una soluzione ipertonica per estrarre l'acqua e concentrare il virus purificato.

Per la purificazione del virus della malattia di Newcastle o NDV, innanzitutto preparare il sistema sperimentale precedentemente allestito facendo passare 50 millilitri di PBS attraverso di esso.

Fermare la pompa quando nel tubo rimangono circa cinque millilitri di PBS. Successivamente, collegare un filtro a profondità con una capacità di ritenzione da uno a tre micrometri al tubo. Per sfiatare il filtro, rimuovere il secondo cappuccio dal lato apicale del filtro a profondità, quindi iniziare a far passare ulteriori 50 millilitri di PBS attraverso il sistema.

Una volta che il PBS inizia a fluire attraverso il vent alla sommità del filtro, chiudere la porta e continuare a far scorrere il PBS attraverso i tubi. Successivamente, sostituire il contenitore per rifiuti con un nuovo contenitore sterile di raccolta e iniziare a far passare il liquido allantoinico attraverso il filtro a profondità. Quindi, configurare il sistema di filtrazione tangenziale (TFF) in una conformazione aperta ed eseguire come descritto nel manoscritto.

Quando nel serbatoio rimangono circa cinque millilitri di liquido, interrompere la pompa e aggiungere nel serbatoio il liquido allanticoico filtrato in profondità. Quindi riprendere il flusso della pompa. Per evitare il taglio del virus, è fondamentale assicurarsi che la pressione del sistema non superi 10 pound force per square inch.

Per aumentare l'eluzione, si deve utilizzare una combinazione della velocità della pompa peristaltica e delle pinze a C. Lasciare nel serbatoio da 150 a 100 millilitri di liquido allantico, interrompere la pompa e sostituire il tampone aggiungendo da 150 a 200 millilitri di tampone ML. Interrompere nuovamente la pompa quando nel serbatoio rimangono da cinque a dieci millilitri di liquido, quindi chiudere le linee di scarto utilizzando due pinze a C.

Scollegare la linea di rifiuto che alimenta il serbatoio e inserirla in un tubo conico da 50 millilitri. Quindi riprendere il flusso e sospendere quando rimangono poche gocce di liquido nel serbatoio. Successivamente, rimuovere le morsetti a C dalle linee di scarto e ricollegare la linea di alimentazione del rifiuto al serbatoio.

Nel frattempo, per preparare la centrifugazione ultrarapida su gradiente di densità al iodixanolo, aggiungere innanzitutto 0,5 millilitri di iodixanolo al 40% in un tubo ultracentrifuga da 13,2 millilitri con apertura superiore. Successivamente, preparare la colonna aggiungendo in successione 2,5 millilitri di iodixanolo al 20% e 2,5 millilitri di iodixanolo al 10%. Prima della centrifugazione ultrarapida, aggiungere con attenzione dalla 6 ai 6,5 millilitri della soluzione virale eluita dal sistema TFF sulla colonna di iodixanolo, senza alterare il gradiente.

Dopo l'ultracentrifugazione, rimuovere i tubi con una coppia di pinze sterili. La banda bersaglio dovrebbe essere una banda ampia compresa tra i gradienti del 10 e del 20%. Successivamente, posizionare il tubo sopra un becher utilizzando un supporto per provette.

Successivamente, fissare un ago da 18 gauge di 1,5 pollici a una siringa da cinque millilitri, quindi forare il lato del tubo dell'ultracentrifuga con l'ago ed estrarre la banda bersaglio estendendo lentamente lo stantuffo. Dopo aver rimosso l'iodixanolo dalla soluzione virale come descritto nel manoscritto, utilizzare una siringa per iniettare con attenzione il virus in una cassetta per dialisi. Per concentrare la soluzione virale, rimuovere la cassetta per dialisi dal tampone di dialisi e collocarla in un piccolo sacchetto di plastica richiudibile.

Quindi aggiungere da 15 a 25 millilitri di polietilene glicole al 40% nel sacchetto in modo che la cassetta per dialisi sia completamente immersa.