Riprogrammazione di cellule ematiche umane in cellule staminali pluripotenti indotte mediante virus Sendai

Prelevare una coltura di cellule mononucleate del sangue periferico umano (PBMCs).

Aggiungere il virus Sendai che codifica i fattori di trascrizione per la riprogrammazione. Coprire e sigillare la piastra.

Centrifugare per favorire il contatto virus-cellula e incubare.

Dopo la fusione del virus, l'RNA virale esprime fattori di trascrizione che attivano i geni di pluripotenza cellulare e reprimono i geni specifici della linea per avviare il riprogrammazione.

Nel frattempo, un sottoinsieme di PBMC trasdotti si trasforma in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) ed esprime proteine di adesione.

Trasferirli in una pozzetta rivestita con matrice e centrifugare le cellule. Sostituire il soprannatante con un mezzo di crescita.

Dopo l'incubazione, le iPSC aderiscono alla matrice, mentre i PBMC transdotti non aderenti rimangono in sospensione.

Trasferire la sospensione in un pozzetto rivestito e centrifugare. Aggiungere il mezzo al pozzetto originale e incubare entrambi.

I PBMC transdotti rimanenti iniziano il riprogrammamento, si trasformano in iPSC e aderiscono. Questo passaggio massimizza il trattenimento delle cellule riprogrammate.

Sostituire il mezzo ogni giorno per sostenere la crescita delle iPSC.

In questo procedimento, trasferire le cellule del sangue in un tubo conico da 15 millilitri e contarle utilizzando un emocitometro. Successivamente, preparare tre per dieci alla quinta cellule per la trasduzione e centrifugare le cellule a 515 ×g per cinque minuti a temperatura ambiente.

In seguito, eliminare il soprannatante per aspirazione e risospendere le cellule in 0,5 millilitri di mezzo per cellule del sangue. Quindi, trasferire le cellule in una pozzetta di una piastra a 24 pozzette non rivestita. Scongelare la miscela del virus Sendai in ghiaccio e aggiungerla alle cellule sospese.

Sigillare la piastra con una pellicola adesiva e centrifugarla a 1.150 ×g per 30 minuti a 30 °C. Dopo la centrifugazione, incubare le cellule a 37 °C in 5% di CO₂ per tutta la notte. Per rivestire una piastra a 24 pozzetti con vitronectina, il giorno successivo, diluire la soluzione di vitronectina in PBS per ottenere una concentrazione finale di 5 µg/mL.

Successivamente, aggiungere un millilitro di vitronectina in una pozzetta e incubare a temperatura ambiente per almeno un'ora. Dopo questo periodo, rimuovere la soluzione di rivestimento e trasferire tutti i mezzi contenenti le cellule e il virus nella pozzetta rivestita. Quindi, raccogliere le cellule rimanenti con un ulteriore 0,5 millilitri di mezzo fresco per cellule del sangue e aggiungerli alla pozzetta contenente le cellule.

Successivamente, centrifugare la piastra a 1.150 × g per dieci minuti a 35 °C, quindi mantenere le cellule a 37 °C in 5% di CO₂ durante la notte. Per il secondo trasferimento cellulare, ricoprire il pozzetto con 5 µg/ml di vitronectina come descritto in precedenza. Utilizzare un pozzetto della piastra per ogni trasduzione e trasferire la sospensione cellulare dalla prima piastra alla nuova piastra di vitronectina appena ricoperta.

Nel frattempo, aggiungere un millilitro di mezzo iPSC in una pozzetta della prima piastra per il mantenimento e incubare a 37 gradi Celsius in presenza di 5% di anidride carbonica, con un cambio giornaliero del mezzo con mezzo iPSC fresco. Le colonie appariranno dal giorno 14 al giorno 21 dopo la trasduzione. Centrifugare la piastra appena rivestita, contenente le cellule in sospensione, a 1.150 ×g a 35 gradi Celsius per dieci minuti.

Dopo la centrifugazione, incubare le cellule a 37 gradi Celsius in presenza di anidride carbonica al 5%, durante la notte. Il giorno successivo, rimuovere il soprannatante e sostituirlo con mezzo fresco per cellule staminali pluripotenti indotte. Mantenere le cellule aderenti con un cambio giornaliero di mezzo, fino al raggiungimento dell'80% di confluenza.