Analisi dell'internalizzazione del virus dell'influenza tramite saggio di blocco con streptavidina

Iniziare con provette contenenti cellule epiteliali polmonari umane.

Aggiungere virus dell'influenza biotinilati e incubare sul ghiaccio. I virus si legano alla superficie cellulare senza essere internalizzati.

Centrifugare per separare le cellule legate al virus, rimuovere il sopranatante e risospendere.

Nel tubo del punto temporale iniziale, aggiungere streptavidina non marcata, che si lega ai virus biotinilati, formando complessi.

Aggiungere streptavidina marcata con fluorocromo, che non si lega al complesso virus streptavidina-biotina. Lavare e fissare le cellule.

Incubare il campione del punto temporale successivo a una temperatura più elevata, consentendo l'internalizzazione del virus, quindi riportare sul ghiaccio.

Aggiungere streptavidina non marcata e un agente bloccante dell'internalizzazione, che impedisce l'ulteriore assorbimento virale, quindi incubare. La streptavidina si lega ai virus biotinilati legati alla superficie, quindi lavare.

Fissare le cellule e aggiungere un buffer contenente un detergente per permeabilizzarle.

Lavare e aggiungere lo streptavidina marcata con fluoroforo, che entra nelle cellule e si lega alla biotina.

Analizzare i campioni mediante citometria a flusso.

Una fluorescenza più intensa nel punto temporale successivo conferma un'efficace internalizzazione virale.

Dopo aver ripetuto il lavaggio un'altra volta, raffreddare i tubi in ghiaccio per 10 minuti. Una volta raffreddati i tubi, centrifugare nuovamente e utilizzare 100 microlitri di virus biotinilato diluito in PBS di infezione per risospendere i pellet dopo un'incubazione in ghiaccio di un'ora; ripetere quindi la centrifugazione e lavare con PBS due volte, elaborando i seguenti campioni in parallelo il più possibile per i campioni a zero minuti.

Per trattare i campioni a zero minuti più STV, centrifugare i tubi, rimuovere il sopranatante e utilizzare 15 microlitri di STV al 2% di BSA e 0,1% di azide di sodio in PBS per risospendere il pellet cellulare. Incubare sul ghiaccio per 30 minuti. Quindi centrifugare e lavare le cellule due volte con PBS dopo la fissazione con PFA come appena dimostrato, quindi conservare i campioni a quattro gradi Celsius.

Per i campioni di 30 minuti più STV. Dopo la centrifugazione, risospendere i campioni in 200 microlitri di PBS con 2% di BSA, seguendo un'incubazione a 37 gradi Celsius per 30 minuti.

Centrifugare e risospendere le cellule in 50 microlitri di STV con 2% BSA e 0,1% azide di sodio in PBS, incubare sul ghiaccio per 30 minuti prima di lavare e fissare. Successivamente, dopo aver permeabilizzato e colorato tutti i campioni con STV-Cy3, seguendo le indicazioni nel protocollo scritto, conservare i campioni a quattro gradi Celsius. Infine, analizzare i campioni mediante citometria a flusso.