Analisi dell'internalizzazione del virus dell'influenza tramite saggio di blocco con streptavidina

Iniziare con provette contenenti cellule epiteliali polmonari umane.

Aggiungere virus dell'influenza biotinilati e incubare sul ghiaccio. I virus si legano alla superficie cellulare senza essere internalizzati.

Centrifugare per separare le cellule legate al virus, rimuovere il sopranatante e risospendere.

Nel tubo del punto temporale iniziale, aggiungere streptavidina non marcata, che si lega ai virus biotinilati, formando complessi.

Aggiungere streptavidina marcata con fluorocromo, che non si lega al complesso virus streptavidina-biotina. Lavare e fissare le cellule.

Incubare il campione del punto temporale successivo a una temperatura più elevata, consentendo l'internalizzazione del virus, quindi riportare sul ghiaccio.

Aggiungere streptavidina non marcata e un agente bloccante dell'internalizzazione, che impedisce l'ulteriore assorbimento virale, quindi incubare. La streptavidina si lega ai virus biotinilati legati alla superficie, quindi lavare.

Fissare le cellule e aggiungere un buffer contenente un detergente per permeabilizzarle.

Lavare e aggiungere lo streptavidina marcata con fluoroforo, che entra nelle cellule e si lega alla biotina.

Analizzare i campioni mediante citometria a flu