Valutazione dell'inibizione della crescita batterica mediata da fagi mediante misurazioni della densità ottica

Iniziare con una piastra multipozzetta contenente una sospensione di fagi diluita in serie in un brodo ricco di nutrienti come trattamento e brodo privo di fagi come controllo.

Aggiungere E. coli in ciascun pozzetto. Utilizzando uno spettrofotometro, misurare la densità ottica (OD) di base per registrare la concentrazione batterica iniziale.

Successivamente, incubare la piastra per consentire la crescita batterica e l'infezione da fago.

Nel controllo, i batteri utilizzano i nutrienti e si proliferano, aumentando l'OD.

Nel trattamento, i fagi si legano ai recettori della superficie batterica e iniettano i loro genomi nel citoplasma.

Utilizzando il macchinario della cellula ospite, il genoma virale si replica e produce proteine virali, che si assemblano in nuove particelle virali. Queste particelle lisano la cellula, liberando i discendenti.

Misurare l'OD a intervalli per confrontare la crescita batterica.

I pozzetti di controllo mostrano un aumento progressivo dell'OD, mentre i pozzetti trattati con fagi mostrano valori di OD più bassi, con riduzioni maggiori a concentrazioni più elevate di fagi.

Questo aiuta a determinare la concentrazione di fagi necessaria per l'inibizione massima della crescita batterica.

Per iniziare, impostare il saggio con micropiastre utilizzando punte filtrate per evitare contaminazioni incrociate. Per prima cosa, aggiungere 180 microlitri di mTSB nelle pozzette delle colonne da uno a 12 della micropiastra a 96 pozzette. Successivamente, preparare diluizioni seriali decrescenti di ciascun fago nelle colonne da uno a otto delle micropiastre sterili a 96 pozzette per impostare il saggio. Aggiungere 20 microlitri di fagi singoli o cocktail di fagi nelle pozzette da uno a otto della riga superiore A della micropiastra.

Per il controllo senza fagi e il controllo vuoto, aggiungere 20 microlitri di mTSB nella pozzetta superiore delle colonne da nove a 12. Durante la pipettaggio, mescolare il contenuto delle pozzette mediante aspirazione delicata e ripetuta almeno cinque volte, cambiando i puntali tra una diluizione e l'altra. Rimuovere 20 microlitri dall'ultima riga H, quindi preparare un serbatoio per il ceppo batterico in esame trasferendo due-tre millilitri della coltura diluita nel serbatoio mediante una pipetta da un millilitro.

Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 20 microlitri della coltura batterica diluita in ogni pozzetto delle colonne da uno a 10, cambiando i puntali dopo ogni aggiunta. Coprire e incubare la piastra microlitrica a 37 gradi Celsius. A intervalli di due ore, rimuovere la piastra microlitrica dall'incubatore e leggere la piastra utilizzando un lettore di piastre.

In alternativa, incubare la piastra in un lettore di micropiastre e leggerla nel tempo.