JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Microbiologia
0 visualizzazioni • 2:48 min. • August 31st, 2026
Prelevare una coltura cellulare di mammifero in fase stazionaria con replicazione del DNA minima e raccogliere il mezzo condizionato.
Aggiungere il virus dell'herpes simplex (HSV) e incubare con agitazione occasionale per favorire l'attacco virale. Lavare per rimuovere il virus non legato e ripristinare il mezzo condizionato.
Dopo l'incubazione, il virus si fonde con la membrana dell'ospite, rilasciando il nucleocapside nel citoplasma.
Il dsDNA virale entra nel nucleo, si circolarizza ed esprime le proteine virali necessarie per la replicazione del DNA virale.
Le proteine virali e quelle dell'ospite svolgono il DNA virale e sintetizzano un primer di RNA. Successivamente, il complesso della DNA polimerasi virale si lega ed estende il primer per la sintesi del DNA.
Man mano che la replicazione procede, aggiungere un analogo dei nucleosidi al terreno di coltura. Questo entra nelle cellule e viene convertito in forma tri-fosfata.
Poiché la replicazione del DNA dell'ospite è minima, l'analoghi viene incorporato in modo preferenziale nel DNA virale in replicazione, etichettando così i genomi virali.
I genomi virali marcati sono pronti per l'analisi proteomica a valle delle proteine associate.
Iniziare questa procedura coltivando le cellule MRC-5 come descritto nel protocollo testuale. Successivamente, diluire l'HSV-1 in soluzione salina tamponata al tris fredda o TBS. Per i passaggi seguenti, è importante spegnere il ventilatore e la cappa per colture cellulari per evitare che le cellule si secchino.
Utilizzare una pipetta per trasferire il mezzo di crescita dalle cellule MRC-5 in un contenitore sterile, da aggiungere nuovamente alle cellule dopo l'infezione. Infettare le cellule aggiungendo sette millilitri di virus diluito alle cellule. Agitare delicatamente le cellule ogni 10 minuti per un'ora a temperatura ambiente.
Dopo l'adsorbimento, aspirare l'inoculo, risciacquare le cellule con 50 millilitri di TBS a temperatura ambiente e sostituire il mezzo di crescita originale. Quindi, incubare le cellule a 37 gradi Celsius in presenza di 5% di anidride carbonica. Dopo l'inizio della replicazione del DNA virale, intorno a quattro ore post-infezione, etichettare il DNA virale in replicazione.
Per fare ciò, diluire l'EdC in un millilitro di mezzo di crescita e aggiungerlo al mezzo di coltura cellulare delle cellule infette per due-quattro ore.