Isolamento di proteine da complessi DNA virale-proteina

Prendere i nuclei cellulari contenenti genomi virali, etichettati con nucleotidi modificati con alchino.

Sospendere i nuclei in una miscela di azide biotinilata e ioni rameici, quindi incubare.

L'ione rameico favorisce il legame covalente tra il gruppo azide e il gruppo alchino.

Centrifugare e scartare il soprannatante.

Risospendere nel buffer, trasferire e centrifugare per ottenere il pellet.

Congelare rapidamente, quindi scongelare il pellet per facilitare la lisi.

Risospendere e sottoporre a sonica per lisare i nuclei.

Centrifugare e raccogliere il surnatante contenente i complessi proteina-DNA virale.

Filtrare il soprannatante per rimuovere i contaminanti.

Diluire il filtrato.

Aggiungere le perle magnetiche rivestite di streptavidina e incubare per favorire il legame con i complessi proteina-DNA biotinilati.

Applicare un campo magnetico per raccogliere le perle e lavare per rimuovere i contaminanti.

Ripetere il lavaggio.

Aggiungere un buffer di eluizione e riscaldare per separare e denaturare le proteine.

Separare le perle magnetiche e raccogliere l'eluito.

Congelare rapidamente le proteine isolate. Conservare a temperature ultra-basse per ulteriori analisi.

Dopo aver completamente rimosso il PBS, risospendere il pellet nucleare in 10 millilitri di mix per la reazione click, pipettando delicatamente su e giù cinque volte con una pipetta da 10 millilitri. Ruotare il campione per un'ora a quattro gradi Celsius, prima di centrifugare nuovamente i nuclei come in precedenza.

Rimuovere completamente la miscela della reazione click, quindi lavare il pellet ri-sospendendolo delicatamente in 10 millilitri di PBS e centrifugando nuovamente. A questo punto, ri-sospendere attentamente il pellet nucleare in un millilitro di PBS e trasferire la soluzione in una provetta microcentrifuga da 1,5 millilitri. Dopo la centrifugazione, rimuovere completamente il PBS e congelare rapidamente il pellet in azoto liquido.

A questo punto, il pellet può essere conservato a -80 °C oppure si può proseguire con la procedura. Per lisare i nuclei e frammentare il DNA, risospendere i nuclei scongelati in 500 µL di Buffer B1 mediante pipettaggio su e giù. Incubare la sospensione sul ghiaccio per 45 minuti.

Quindi, sottoporre i campioni a sonicazione sei volte per 30 secondi ciascuna al 40% di ampiezza, utilizzando una sonda microtip da tre millimetri. Posizionare i campioni sul ghiaccio per almeno 30 secondi tra un impulso e l'altro. Dopo la sonicazione, i campioni dovrebbero apparire chiari, non torbidi.

Centrifugare a 14.000 x G per 10 minuti a quattro gradi Celsius per raccogliere i detriti cellulari in pellet. La dimensione del pellet dovrebbe ridursi notevolmente; filtrare il soprannatante attraverso un filtro cellulare da 100 micron e raccogliere il flusso passante. Successivamente, aggiungere 500 microlitri di Buffer B2 al soprannatante filtrato.

Per legare il DNA biotinilato alle perle rivestite di streptavidina, preparare le perle magnetiche con streptavidina trasferendo 300 microlitri di sospensione di perle in una provetta microcentrifuga da 1,5 millilitro. Preparare una provetta di perle per ogni campione. Lavare le perle tre volte con un millilitro di Buffer B2 agitando vortex per ri-sospendere, applicando alla calamita per separare le perle ed aspirando il buffer di lavaggio.

Quindi, aggiungere 900 microlitri del campione alle perle lavate. Il resto del campione verrà utilizzato per l'isolamento del DNA e delle proteine in ingresso. Ruotare la sospensione tutta la notte a quattro gradi Celsius.

Il giorno successivo, posizionare i campioni in un portaprovette magnetico per microcentrifuga e rimuovere il soprannatante. Ri-sospendere delicatamente le perle in un millilitro di Buffer B2, quindi ruotare a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Rimuovere nuovamente il soprannatante utilizzando il portaprovette magnetico per microcentrifuga.

Questa volta, risospendere delicatamente le perle in un millilitro di Buffer B3 e ruotare a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Dopo aver rimosso il soprannatante dalla miscela di perle utilizzando il magnete, risospendere le perle in 50 microlitri di buffer campione 2x Laemmli per eluire i complessi DNA-proteina. Successivamente, far bollire i campioni a 95 gradi Celsius per 15 minuti.

Vortexare una miscela prima di centrifugare rapidamente i campioni in un microcentrifuga. Applicare i campioni sul magnete e trasferire l'eluito in un nuovo tubo. Infine, congelare rapidamente i campioni e conservarli a 80 gradi celsius.

Eseguire l'analisi delle proteine come descritto nel protocollo testuale.