Un dispositivo rivestito in silicone stampato in 3D per modellare l'infezione del tratto urinario associata al catetere

Prelevare una piastra a più pozzetti contenente urina umana sterile.

Inoculare i pozzetti del test con i batteri. I pozzetti di controllo contengono solo urina.

Prendi un dispositivo stampato in 3D e rivestito in silicone che imita la superficie interna di un catetere, dove i biofilm si sviluppano durante le infezioni urinarie associate al catetere.

Posizionarlo nei pozzetti, sigillare la piastra e incubarla.

I batteri si attaccano alla superficie del dispositivo, utilizzano i nutrienti dell'urina e formano biofilm.

Sciacquare il dispositivo con un tampone per rimuovere i batteri legati in modo lasco.

Posizionare il dispositivo in una piastra multipozzetto contenente cristallovioletto, che interagisce con il biofilm per colorarlo.

Sciacquare con acqua e asciugare.

Immergere il dispositivo in una piastra a più pozzetti contenente una soluzione acida per interrompere le interazioni colorante-biofilm e rilasciare il colorante nella soluzione.

Misurare l'assorbanza delle soluzioni in ciascun pozzetto utilizzando uno spettrofotometro.

Una maggiore assorbanza nei pozzetti di test rispetto ai pozzetti di controllo conferma la formazione di biofilm sul dispositivo, indicandone l'idoneità a modellare l'infezione del tratto urinario associata al catetere.

Per iniziare, ottenere un campione di urina umana aggregato. Aliquotare 135 microlitri di urina umana aggregata in ciascun pozzetto di prova di una piastra da 96 pozzetti seguendo il layout designato.

Inoculare ogni pozzetto durante il test con 15 microlitri di coltura batterica notturna normalizzata per ottenere un volume finale di 150 microlitri per pozzetto. Riservare almeno 100 microlitri di questa coltura per le successive fasi di convalida della diluizione seriale.

Preparare pozzetti di controllo negativo aggiungendo 150 microlitri di urina umana sterile in pool nei pozzetti designati.

Ora, inserisci i pioli nei pozzetti corrispondenti. Premere il coperchio del piolo finché non si trova a filo sulla piastra e fissarlo con il coperchio della micropiastra, fissandolo con nastro adesivo se necessario.

Quindi posizionare i modelli di pioli in una vasca di plastica sigillata o in un sacchetto contenente un rotolo blu umido per evitare l'evaporazione. Incubare staticamente per 24 ore a 37 gradi Celsius.

Per la convalida dell'inoculo, aliquotare 180 microlitri di PBS nelle file da 2 a 6 della prima colonna di una piastra a 96 pozzetti prima di aggiungere la coltura riservata.

A questo punto, trasferire 20 microlitri dal primo pozzetto al secondo pozzetto, mescolando delicatamente pipettando su e giù. Continuare le diluizioni seriali fino a quando l'inoculo iniziale non è stato diluito fino al pozzetto finale.

Quindi, piastra 10 punti da microlitro da ciascuna diluizione su un terreno solido appropriato in triplicato. Dopo l'incubazione notturna a 37 gradi Celsius, contare le colonie da ogni punto.

Per la quantificazione del biofilm, rimuovere il modello a pioli dalla micropiastra e capovolgerlo sotto una fiamma o all'interno di una cabina di sicurezza microbiologica, con i pioli rivolti verso l'alto. Eliminare le micropiastre usate.

Trasferire il coperchio del piolo in una micropiastra fresca contenente 180 microlitri di aliquote di PBS sterile per sciacquare le cellule non aderenti.

Quindi, lavorando in modo asettico, posizionare un rack per provette in vetro sterile sul banco e fissare la parte superiore del rack montata che tiene il coperchio del piolo.

Con una micropipetta, aliquotare 600 microlitri di PBS sterile in ciascuna provetta. Ora, inserisci il coperchio del piolo nel rack, assicurandoti che i pioli siano allineati con le provette. Rimuovere il nastro dell'autoclave dal coperchio.

Utilizzare una pinza sterile per spingere ogni piolo attraverso il coperchio nelle provette direttamente sottostanti. Quindi riposizionare i tappi delle provette e agitare ciascuna provetta per 60 secondi per rimuovere le cellule associate al biofilm.

Rimuovere 100 microlitri da ogni provetta vortexed ed eseguire diluizioni seriali in PBS sterile come fatto in precedenza.

Per colorare le cellule con cristallovioletto, pipettare 180 microlitri di cristallovioletto allo 0,1% in peso per volume in acqua distillata sterile nei 24 pozzetti in prova di una piastra a 96 pozzetti. Inserire il modello di piolo risciacquato nei pozzetti corrispondenti e incubare a temperatura ambiente per 20 minuti.

Dopo la colorazione, rimuovere il modello di piolo dalla piastra e gettare la piastra usata. In una vasca pulita, sciacquare l'intero modello di piolo in acqua corrente del rubinetto agitando delicatamente.

Dopo altri 2 lavaggi, capovolgere il modello a molletta e lasciarlo asciugare completamente a temperatura ambiente. Quindi aggiungere 180 microlitri di acido acetico al 30% a una nuova piastra a 96 pozzetti. Inserire il modello di piolo essiccato nei pozzetti corrispondenti.

Al termine dell'incubazione, rimuovere il modello di piolo dalla micropiastra. Misurare la densità ottica dei pozzetti colorati a 540 nanometri utilizzando un lettore di micropiastre o uno spettrofotometro.