JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Microbiologia
0 visualizzazioni • 4:35 min. • August 31st, 2026
Iniziare con cellule di mammifero infettate da un adenovirus.
Eseguire cicli ripetuti di congelamento-scongelamento per lisare le cellule e rilasciare i virioni.
Centrifugare il lisato per formare un pellet dei detriti. Raccogliere il soprannatante contenente le particelle virali.
Deporre il surnatante virale su un gradiente a gradini di cloruro di cesio per la separazione in base alla densità.
Ultracentrifugare per consentire alle particelle virali di migrare in base alle loro densità di galleggiamento.
I virioni integri che contengono il genoma adenovirale completo sono più densi a causa del DNA impacchettato e si depositano in una banda più bassa, mentre le capside vuote e i detriti più leggeri rimangono negli strati superiori.
Rimuovere gli strati superiori. Raccogliere la banda inferiore di virioni contenenti il genoma.
Risospendere i virioni in cloruro di cesio a densità uniforme e sottoporli nuovamente a ultracentrifugazione per affinare la separazione e concentrare le particelle complete.
Scartare gli strati superiori e recuperare la banda inferiore.
Dializzare il campione per rimuovere il cloruro di cesio.
I vettori adenovirali ad alta purezza, contenenti il genoma, sono ora pronti per le applicazioni a valle.
Per preparare il lisato virale per la purificazione mediante gradiente al cloruro di cesio, sottoporre la sospensione cellulare del virus a quattro cicli di congelamento/scongelamento. Successivamente, centrifugare il lisato virale a 500 × g per otto minuti a temperatura ambiente.
Quindi, raccogliere il soprannatante contenente l'adenovirus ad alta capacità. Pipettare con attenzione e lentamente le soluzioni di cloruro di cesio nei tubi nel seguente ordine: 0,5 millilitri di soluzione da 1,5 grammi per centimetro cubo, tre millilitri di soluzione da 1,35 grammi per centimetro cubo e 3,5 millilitri di soluzione da 1,25 grammi per centimetro cubo. Sovrapporre circa 4,5 millilitri di soprannatante del vettore chiarificato sopra lo strato da 1,25 grammi per centimetro cubo.
Centrifugare i gradienti in un ultracentrifugo utilizzando un rotore a braccio oscillante a 12 gradi Celsius per almeno due ore a 226.000 ×g per separare le particelle virali contenenti il genoma adenovirale ad alta capacità dalle particelle vuote e dai detriti cellulari. Al termine della centrifugazione, si forma una banda diffusa di detriti cellulari in cima alle provette. Al di sotto di questa, possono essere osservate due bande bianche.
La banda superiore contiene particelle vuote, mentre quella inferiore è l'adenovirus ad alta capacità. Rimuovere con attenzione gli strati di detriti cellulari e le particelle vuote. Quindi, raccogliere un millilitro delle bande inferiori da ogni provetta.
Trasferire il virus in una provetta sterile da 50 millilitri. Aggiungere fino a 24 millilitri di soluzione di cloruro di cesio a 1,35 grammi per centimetro cubo alle particelle virali raccolte e mescolare con cura. Riempire le provette della centrifuga fino all'orlo con la soluzione virale di cloruro di cesio a 1,35 grammi per centimetro cubo.
Quindi centrifugare tutta la notte a 226.000 ×g a 12 gradi Celsius in un ultracentrifugo utilizzando un rotore a pendolo con accelerazione e decelerazione lente. Rimuovere i livelli superiori dalla parte superiore utilizzando una pipetta. Successivamente, raccogliere l'adenovirus ad alta capacità presente nella marcata banda inferiore utilizzando una nuova punta di pipetta.
Infine, dializzare le particelle virali raccolte per lo scambio del tampone. Quindi, determinare il titolo della preparazione finale seguendo le istruzioni dettagliate nel protocollo scritto.