JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Microbiologia
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Iniziare con un sistema di bioreattore contenente un impalcatura di fegato di ratto descelularizzato ripopolato con cellule epatiche umane.
Il scaffold viene mantenuto in un sistema a flusso che circola il mezzo per fornire nutrienti.
Caricare una siringa con un tampone contenente un vettore virale ricombinante adeno-associato.
Il vettore trasporta un DNA auto-complementare con una cassetta di transgene che codifica per un reporter fluorescente e un RNA di silenziamento genico.
Fermare il flusso del mezzo e scollegare il tubo di ingresso.
Iniettare il vettore attraverso il principale vaso sanguigno che fornisce lo scaffold.
Incubare per consentire l'interazione tra vettore e cellule.
Il vettore entra nelle cellule epatiche mediante endocitosi mediata da recettore.
Una volta all'interno, il vettore fuoriesce dall'endosoma e rilascia il suo DNA auto-complementare nel nucleo.
Il DNA autocomplementare consente un'espressione diretta del transgene, producendo una proteina fluorescente e un RNA di silenziamento genico.
Riprendere gradualmente il flusso del mezzo per ripristinare la circolazione attraverso lo scaffold.
Il modello di fegato transdotto è ora adatto per analisi successive.
Ora si proceda alla trasduzione del modello epatico. Per prima cosa, si prelevino 27 trilioni di vettori in cinque millilitri di PBS e si carichino in una siringa. Il rosso fenolo può essere aggiunto alla concentrazione di 5 microgrammi per millilitro.
Quindi disconnettere il fegato dal circuito del mezzo e iniettare i vettori nel sistema. Dopo l'iniezione, incubare il sistema per un'ora senza pompaggio. Successivamente aumentare gradualmente il flusso come descritto in precedenza.
In seguito, durante l'incubazione del fegato transdotto per sei giorni, sostituire 50 millilitri di mezzo ogni due giorni.