Conferma della trasduzione virale in fegato di ratto ricellularizzato mediante colorazione immunoistochimica

Iniziare con tessuto epatico di ratto recellularizzato congelato, contenente epatociti umani, incluso in criomedium.

In questo tessuto, gli epatociti transdotti esprimono la proteina fluorescente verde smeraldo (EmGFP), una proteina reporter codificata dal vettore virale.

Utilizzare un criostato per tagliare sezioni sottili che mantengano l'architettura cellulare e tissutale. Trasferire le sezioni su un vetrino.

Trattare le sezioni con un detergente delicato per permeabilizzare la membrana cellulare.

Applicare un anticorpo primario anti-EmGFP che si lega specificamente alla proteina reporter fluorescente espressa nelle cellule transdotte.

Lavare per rimuovere gli anticorpi non legati.

Introdurre un anticorpo secondario coniugato a un fluorocromo rosso, che si lega all'anticorpo primario, quindi lavare.

Aggiungere un colorante fluorescente blu specifico per il DNA che si lega al DNA cellulare.

Al microscopio a fluorescenza, la colocalizzazione della fluorescenza rossa con i nuclei colorati in blu conferma che gli epatociti transdotti nel tessuto epatico esprimono con successo la proteina reporter virale.

Utilizzando un bisturi, tagliare campioni da ciascun lobo epatico di circa mezzo centime