JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologia
0 visualizzazioni • 3:33 min • August 31st, 2026
Prelevare una coltura cellulare umana.
Aggiungere lentivirus che codificano un shRNA targeting dell'mRNA dell'ospite sotto un promotore responsivo alla tetraciclina, fuso a un operatore.
Il lentivirus contiene anche geni per un repressore della tetraciclina e una proteina di resistenza agli antibiotici, posti sotto un promotore costitutivo.
Incubare per consentire il trasferimento dell'RNA virale nelle cellule ospiti.
L'RNA si converte in cDNA e si integra nel genoma dell'ospite.
Lavare, aggiungere il mezzo di coltura e incubare per consentire l'espressione del repressore della tetraciclina e della proteina resistente all'antibiotico, generando cellule transdotte. Il repressore della tetraciclina si lega all'operatore e sopprime l'espressione dell'RNA a forcina corta (shRNA).
Lavare, aggiungere il mezzo con antibiotico e incubare.
Le cellule transdotte esprimono la proteina di resistenza all'antibiotico, consentendone la sopravvivenza selettiva in presenza dell'antibiotico.
Aggiungere doxyciclina, un analogo della tetraciclina, alla coltura.
La doxiciclina si lega al repressore della tetraciclina, impedendone il legame con l'operatore e consentendo l'espressione dell'RNA a forcina corta (shRNA).
Lo shRNA viene processato in siRNA, che si inserisce nel complesso RISC e degrada l'mRNA bersaglio.
Questo genera cellule con silenziamento condizionale dipendente dalla doxiciclina.
Per generare linee cellulari stabili, iniziare seminando cellule di cancro al colon HCT-116 e cellule di cancro al seno MDA-MB-231 in una piastra a 12 pozzetti con 50.000 cellule per pozzetto.
Incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Quando le cellule raggiungono una confluenza del 60-70%, lavare le cellule con PBS e aggiungere un millilitro di mezzo contenente il virus in ogni pozzetto. Il giorno successivo, rimuovere con attenzione il mezzo contenente il virus mediante aspirazione.
Successivamente, dopo aver lavato le cellule con PBS, aggiungere mezzo contenente FBS privo di tetraciclina. Dopo 72 ore, lavare le cellule come in precedenza e aggiungere mezzo integrato con un microgrammo per millilitro di puromicina per la selezione delle cellule transdotte con il virus. Selezionare le cellule transdotte con il virus coltivandole in presenza di puromicina per tre fino a 14 giorni.
Osservare un parziale effetto citotossico della puromicina nelle pozzette con cellule transdotte con virus. Le cellule non transdotte non cresceranno in presenza di puromicina.
Verificare l'efficienza del silenziamento condizionale nelle cellule di cancro del colon HCT-116 e nelle cellule di cancro al seno MDA-MB-231 resistenti alla puromicina aggiungendo un mezzo con diverse concentrazioni di doxiciclina e coltivando le cellule per 72 ore.