JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Microbiologia
0 visualizzazioni • 3:33 min. • August 31st, 2026
Prelevare una coltura cellulare umana.
Aggiungere lentivirus che codificano un shRNA targeting dell'mRNA dell'ospite sotto un promotore responsivo alla tetraciclina, fuso a un operatore.
Il lentivirus contiene anche geni per un repressore della tetraciclina e una proteina di resistenza agli antibiotici, posti sotto un promotore costitutivo.
Incubare per consentire il trasferimento dell'RNA virale nelle cellule ospiti.
L'RNA si converte in cDNA e si integra nel genoma dell'ospite.
Lavare, aggiungere il mezzo di coltura e incubare per consentire l'espressione del repressore della tetraciclina e della proteina resistente all'antibiotico, generando cellule transdotte. Il repressore della tetraciclina si lega all'operatore e sopprime l'espressione dell'RNA a forcina corta (shRNA).
Lavare, aggiungere il mezzo con antibiotico e incubare.
Le cellule transdotte esprimono la proteina di resistenza all'antibiotico, consentendone la sopravvivenza selettiva in presenza dell'antibiotico.
Aggiungere doxyciclina, un analogo della tetraciclina, alla coltura.
La doxiciclina si lega al repressore della tetraciclina, impedendone il legame con l'operatore e consentendo l'espressione dell'RNA a forcina corta (sh
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