JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologia
0 visualizzazioni • 3:51 min • August 31st, 2026
Prelevare vettori lentivirali contenenti l'antigene p24 dell'HIV-1, un marcatore proteico utilizzato per il rilevamento.
Aggiungere un detergente per lisare e rilasciare la p24, quindi diluire il campione in modo seriale.
Prendere una micropiastra rivestita con anticorpi monoclonali anti-p24 e un agente bloccante per prevenire il legame non specifico.
Aggiungere le diluizioni del campione e gli standard p24 come riferimenti.
Incubare per permettere l'interazione del p24 con gli anticorpi attraverso un epitopo specifico, quindi rimuovere i componenti non legati.
Incubare con anticorpi policlonali anti-p24 che si legano a diversi epitopi su p24. Rimuovere eventuali anticorpi non legati.
Aggiungere anticorpi marcati con perossidasi che si legano agli anticorpi policlonali. Rimuovere gli anticorpi non legati.
Aggiungere un substrato perossidasi che si trasforma in un prodotto colorato.
Aggiungere un acido per inattivare la perossidasi e stabilizzare il prodotto.
Misurare l'assorbanza corrispondente all'intensità del colore, che è proporzionale alla concentrazione di p24.
Generare il grafico standard e stimare le concentrazioni del campione per determinare il titolo virale.
Rivestire una piastra da 96 pozzetti ad alta capacità di legame con 100 microlitri di anticorpo monoclonale anti-p24 in una diluizione di 1:1.500 secondo le indicazioni del programma NIH AIDS per il kit di saggio di cattura dell'antigene p24 dell'HIV-1. Incubare la piastra tutta la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, lavare la piastra tre volte con 200 microlitri di TWEEN-20 0,05% in PBS freddo.
Per evitare legami non specifici, bloccare la piastra con 200 microlitri di albumina sierica bovina al 1% per un'ora a temperatura ambiente. Quindi, lavare la piastra con 200 microlitri di TWEEN-20 0,05% in PBS freddo per tre volte. Successivamente, preparare i campioni di vettore concentrati e non concentrati a una concentrazione finale del 10% diluendo il vettore con acqua bidistillata e Triton X-100.
Successivamente, preparare gli standard di HIV-1 mediante diluizione seriale due volte partendo da cinque nanogrammi per millilitro. Dopo aver diluito i campioni di vettore concentrati e non concentrati, pipettarli sulla piastra in triplicato e incubare a quattro gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, lavare la piastra, quindi aggiungere 100 microlitri di anticorpo policlonale di coniglio anti-p24 su ciascuna piastra e incubare a 37 gradi Celsius per quattro ore.
Dopo sei lavaggi, incubare la piastra con la proteina anti-capra anti-coniglio perossidasi a 37 gradi Celsius per un'ora. Dopo diversi lavaggi, incubare la piastra con il substrato perossidasi TMB a temperatura ambiente per 15 minuti. Aggiungere acido cloridrico uno normale per arrestare la reazione. E leggere l'assorbanza a 450 nanometri con un lettore di piastre per assorbanza.